论文部分内容阅读
人博卡病毒(HBoV)由瑞典科学家在2005年从患有急性呼吸道感染的儿童鼻咽分泌物中检测分离,与牛细小病毒和犬细小病毒同属于细小病毒科、博卡病毒属。HBoV主要感染2岁以下的婴幼儿,是呼吸道疾病感染中继呼吸道合胞病毒、鼻病毒和腺病毒之后的第四大感染源。HBoV1的基因组主要由两端的发卡结构、中间的非结构蛋白NS1、NP1以及结构蛋白VP1/VP2组成。两端的发卡结构以及非结构蛋白NS1和NP1对病毒基因组复制具有重要调控作用,但复制调控的具体机制还不是很清楚。 本研究利用武汉株HBoV1的感染性全长克隆转染HEK293T细胞,通过用Southern blot检测发现NP1对病毒基因组的复制并不是必须的,这与之前报道的MVC(minute virus of canines)病毒以及Salvador株的HBoV1的NP1对病毒基因组复制的重要调控作用是不一致的。序列分析表明武汉株与Salvador病毒株在NS1开放阅读框存在碱基突变。将武汉株的NS1突变为Salvador株NS1的序列同时敲除NP1,此时影响了病毒基因组的复制,提示NS1编码框的两个点突变影响了NP1对病毒基因组复制的调节功能。为进一步验证NS1编码框内点突变对NP1功能影响的普遍性,我们从362份儿童咽拭子样本中通过PCR扩增NS1编码框序列并测序。序列分析表明NS1的C末端存在6种碱基突变且改变了编码的氨基酸。将检测到的C末端的点突变分别构建入感染性克隆并转染细胞之后,发现这些点突变本身对病毒基因组的复制没有影响,而在此基础上敲除NP1时病毒基因组的复制则发生了不同程度的减少,说明NS1的C末端对病毒基因组的复制具有关键调节作用,而NP1对病毒基因组的复制虽不是必须的但可以促进病毒基因组的复制。另外,本文首次揭示了与NS1的C末端序列完美重叠的非结构蛋白UP1也参与了病毒基因组的复制调控。将UP1敲除与回复的实验证实UP1参与调节了病毒基因组的调控,且与NP1协同调节病毒基因组复制,对病毒基因组复制具有促进作用。此外我们进一步鉴定了除已报道的TRS位点和NS1结合位点之外的病毒基因组复制调控的其他潜在顺式作用元件。 综上,我们通过比较两株不同的人博卡病毒以及一系列临床咽拭子样本,阐述了非结构蛋白NS1对病毒基因组复制具有关键调控作用且C末端点突变一定程度上调控了NP1蛋白对病毒基因组的调节作用;NP1对病毒基因组复制具有促进作用但不是必须的。同时,本文也鉴定了UP1对病毒基因组复制具有调控作用,以及不同于已报道文献的NS1结合位点和末端识别位点。本文研究结果进一步解释了病毒基因组复制调控机理,同时也为未来深入探索病毒感染的致病机制提供了一定的理论基础。