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第一部分碘化钾对亚甲基蓝介导的光动力抗铜绿假单胞菌的作用机理目的:研究碘化钾（potassium iodine,KI）对亚甲基蓝（methylene blue,MB）介导的光动力抗菌疗法（antimicrobial photodynamic therapy,aPDT）对铜绿假单胞菌的作用机理。方法:将铜绿假单胞菌制成10~8CFU/ml的菌悬液,对处理后的各组菌悬液进行稀释,形成的菌落数进行平板计数。（1）KI对MB介导的aPDT的影响:实验分为aPDT组,空白对照组,单纯光敏剂组和单纯光照组。aPDT组:MB按不同浓度分别与（或不与）一定浓度的KI、菌悬液混合,避光孵育后,予光能量密度20J/cm~2的红光照射。空白对照组:不加入光敏剂、不予光照。单纯光敏剂组:仅有光敏剂、无光照。单纯光照组:仅光照、无光敏剂。（2）不同浓度KI分别与一定浓度MB、菌悬液混合,避光孵育30min,用红光照射（总能量密度20J/cm~2）。（3）在上述实验的基础上,改变KI加入顺序,分为空白对照组、在KI和MB光照后加入细菌组（after组）、KI-MB和细菌共同孵育组（in组）及MB与细菌孵育离心后再加入KI组（washed组）。（4）MB（终浓度为10μmol/L）加入（或不加入）KI（终浓度为10mmol/L）与菌悬液混合,避光孵育30min,用红光照射（能量密度20J/cm~2）,收集菌悬液,制作细菌切片,通过透射电镜观察细菌形态结构变化。结果:（1）在本研究范围内,KI-MB-aPDT组对铜绿假单胞菌的清除量为6.21个对数级,与MB-aPDT组对铜绿假单胞菌的清除量相比增加了4个对数级,两组相比有统计学意义（P<0.05）。（2）在MB浓度为10μmol/L,KI浓度为0.1mmol/L-5mmol/L的条件下,MB-KI-aPDT组对细菌的清除量为0.9-3个对数级。KI浓度分别为7.5mmol/L和10mmol/L的条件下,完全清除了细菌。（3）在in组可观察到铜绿假单胞菌清除量超过6个对数级,而washed组及after组均未使细菌清除量超过1个对数级。（4）通过透射电镜观察到KI-MB-aPDT作用下的铜绿假单胞菌的形态结构改变,细胞膜结构完整性被破坏,细胞质内结构呈丝状或网状,并且缠绕成团。结论:KI增强了MB介导的aPDT对铜绿假单胞菌的清除效果。在MB浓度、光照条件一定的条件下,KI-MB-aPDT对铜绿假单胞菌的清除效果随KI浓度的升高而增强。在KI-MB-aPDT中起到主要清除作用的物质可能是在aPDT过程中生成的短寿命物质。KI-MB-aPDT作用位点包括细菌细胞膜以及细胞质,具有非特异性。第二部分光动力因素对KI联合MB共同介导aPDT效果的影响目的:研究aPDT是否会造成铜绿假单胞菌耐药,光能量密度和孵育时间对KI-MB-aPDT清除铜绿假单胞菌效果的影响。方法:将铜绿假单胞菌制成10~8CFU/ml菌悬液。（1）KI（终浓度为5 mmol/L）、MB（终浓度为10μmol/L）与菌悬液混合,避光孵育30min,用光能量密度为20J/cm~2的红光照射,反复进行8次aPDT。（2）MB（终浓度为10μmol/L）、菌悬液与（或不与）KI（终浓度为7.5mmol/L）混合,避光孵育30min,改变光能量密度（0J/cm~2、2 J/cm~2、4 J/cm~2、8 J/cm~2和16 J/cm~2）进行aPDT。（3）MB（终浓度为10μmol/L）、菌悬液与（或不与）KI（终浓度为7.5mmol/L）混合,改变孵育时间（0min、5 min、10 min、20 min和30 min）,用光能量密度为16J/cm~2的红光照射。对以上各组处理后的菌悬液进行稀释,形成的菌落数进行平板计数。结果:（1）KI-MB-aPDT使铜绿假单胞菌菌落数均下降约3个对数级。（2）在MB浓度、KI浓度和孵育时间一定的条件下,改变光能量密度（0-16J/cm~2）,MB-aPDT组细菌菌落数清除量升至2个对数级,KI-MB-aPDT组细菌菌落数清除量升至5.4个对数级,两组比较有统计学差异（P<0.05）。（3）在MB浓度、KI浓度和光能量密度一定,孵育时间为5min-20min的条件下,细菌菌落数清除量从1.4个对数级升至5.4个对数级。结论:反复进行aPDT不会造成铜绿假单胞菌耐药。在KI、MB浓度和孵育时间一定的条件下,aPDT对铜绿假单胞菌清除作用随着光能量密度的升高而增强。在KI、MB浓度和光能量密度一定的条件下,aPDT对铜绿假单胞菌的清除效果随孵育时间的延长而增强,但当孵育时间延长至一定时间后,aPDT对铜绿假单胞菌的清除效果不再增强。第三部分泵抑制剂对KI联合MB共同介导aPDT效果的影响目的:研究外排泵抑制剂苯丙氨酸-精氨酸-Β-萘胺（phe-argβ-naphthylamide dihydrochloride,PAβN）对KI-MB-aPDT对铜绿假单胞菌清除效果的影响。研究PAβN加入顺序对KI-MB-aPDT对铜绿假单胞菌清除效果的影响。方法:将铜绿假单胞菌制成10~8CFU/ml菌悬液。（1）实验分为4组。aPDT组:不同浓度的KI分别与MB和及菌悬液混合,避光孵育30min,用能量密度为20J/cm~2的红光照射。PAβN-aPDT组:在aPDT组的基础上加入PAβN,避光孵育30min,用能量密度为20J/cm~2的红光照射。PAβN组:仅有PAβN与菌悬液避光孵育,不予光照。空白对照组:铜绿假单胞菌菌悬液不加入MB、KI和PAβN,不予光照。（2）依据PAβN的加入顺序将实验分为先加入PAβN再加入MB和KI组（PAβN-first组）,先加入MB再加入PAβN组（PAβN-after组）,PAβN与MB和KI孵育组（PAβN-in组）以及空白对照组。PAβN-first组:菌悬液加入PAβN避光孵育,离心去上清,菌团重悬于PBS中,依次加入MB及不同浓度的KI孵育,予能量密度为20J/cm~2的红光照射。PAβN-after组:菌悬液加入MB避光孵育,离心去上清,重悬于PBS并加入PAβN避光孵育,离心去上清,重悬于KI和PBS,予红光照射。PAβN-in组:菌悬液加入PAβN和MB避光孵育,离心去上清,重悬于KI和PBS予红光照射。空白对照组:菌悬液不加入MB、KI及PAβN,不予光照。结果:（1）PAβN增强了KI-MB-aPDT对铜绿假单胞菌的清除效果。（2）在PAβN-first组中铜绿假单胞菌清除量的效果优于PAβN-after组和PAβN-in组,对铜绿假单胞菌的清除作用随KI的浓度升高而增强。结论:PAβN可以进一步增强KI与MB介导的aPDT对铜绿假单胞菌的清除作用,机制可能是通过抑制主动外排泵从而使MB更有效的进入细菌,参与aPDT反应。