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研究目的肺癌是我国发病率和死亡率最高的癌种,具有发病率高、预后差、致死率高的特点。肿瘤微环境（TME）对处于其中的癌细胞的生物学特征有密切而直接的影响。巨噬细胞是TME中主要的肿瘤浸润免疫细胞（TILs）,TME中的巨噬细胞被称为肿瘤相关巨噬细胞（TAM）。大量的研究表明特别是M2型TAM与肿瘤包括肺癌的生长和转移密切相关,但TAM促进肿瘤生长和转移的分子机制尚未明确。中医药中是否包含作用于巨噬细胞特别是M2型TAM的单体成分,能够抑制肺癌的生长和转移,尚未见文献的报道。本研究首先筛选从肺岩宁方中找出调控巨噬细胞M1/M2极化的成分重楼皂苷,体外观察它对M1/M2型巨噬细胞的调控作用。然后在体外模型中观察M1/M2型的不同巨噬细胞对肺癌恶性生物学的影响,并探讨可能存在的分子机制。为抗肺癌生长和转移提供新思路。研究方法研究采用小鼠巨噬细胞株RAW264.7和经PMA诱导后人单核细胞THP-1,鼠源肺腺癌细胞LLC（Lewis）和人肺腺癌细胞A549和H1975作为研究对象。（1）液质联用检测肺岩宁新旧2个处方所含的小分子化合物,为筛选调控巨噬细胞极化的小分子化合物提供依据。（2）CCK-8法检测:不同浓度小分子化合物Polyphyllin（PP）对RAW264.7和PMA诱导后THP-1增值的影响;含PP和不同细胞因子IL-4、IL-6、IFN-γ的巨噬细胞CM（条件培养基）对LLC、A549增值的影响。（3）Annexin V-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒检测:不同浓度小分子化合物Polyphyllin（PP）对RAW264.7和PMA诱导后THP-1凋亡的影响;含PP和不同细胞因子IL-4、IL-6、IFN-γ的巨噬细胞CM（条件培养基）对LLC、A549凋亡的影响。（4）WB检测:采用不同细胞因子体外诱导造成M1-like和M2-like模型,观察PP对不同细胞因子所激活的信号通路和M1/M2极化标志物的影响,确定PP对巨噬细胞极化的调控方向和作用机制;PP和不同细胞因子干预下巨噬细胞的条件培养基对肿瘤细胞迁移和侵袭信号通路的影响。（5）PCR检测PP干预不同极化模型的巨噬细胞,M1/M2标志物和不同极化状态下基因的变化。（6）Transwell小室检测:PP和不同细胞因子干预下巨噬细胞的条件培养基对肺癌细胞迁移运动的影响。（7）免疫荧光观察PP对M1极化的巨噬细胞分子标志的影响。结果1.采用液质联用对肺岩宁新旧2个处方中所含的单体成分的鉴定表明:重楼皂苷是肺岩宁旧方中所含的单体成分。2.细胞增殖（1）0～2.5μM PP作用于RAW264.7细胞,24～48h后与对照组空白培养基相比,CCK-8检测细胞活力没有差异（P＞0.05）,5μM PP作用于RAW264.7细胞,72h后与对照组空白培养基相比,CCK-8检测细胞活力有显著差异（P＜0.0001）。0.625μM的PP作用于RAW264.7细胞72小时后,与对照组相比,细胞活力有所下降,差异有统计学意义（P＜0.05）,2.5～5μM的PP作用RAW264.7细胞48～72h后和对照组相比,细胞活力显著下降（P＜0.0001）。（2）0～1.25μM的PP作用于PMA诱导后的人巨噬细胞THP-1,24h后与对照组相比细胞活力没有变化,2.5～5μM的PP作用THP-1细胞24h后与对照组相比,细胞活力明显下降,差异有显著统计学意义（P＜0.0001）。0～0.3μM的PP作用于THP-1细胞48h后,细胞活力与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）,0.625～1.25μM的PP作用于THP-1细胞48h后,与对照组相比细胞活力有所下降（P＜0.01）,2.5～5μM的PP作用于THP-1细胞48h后细胞活力显著下降,差异有显著统计学意义（P＜0.0001）。0.16μM的PP作用于THP-1细胞72h后,细胞活力变化没有差异（P＞0.05）,0.31μM的PP作用于THP-1细胞72h后,细胞活力有所下降,差异有统计学意义（P＜0.05）,0.63到1.25μM的PP作用于THP-1细胞72h后细胞活力有所下降,差异有统计学意义（P＜0.01）,2.5～5μM的PP作用于THP-1细胞72h后,细胞活力显著下降,差异有显著统计学意义（P＜0.0001）。（3）在24h作用时间下,与空白RAW264.7巨噬细胞条件培养基（CM）相比,含PP的CM对LLC的增殖没有影响（P＞0.05）,而含IFN、含IFN+PP+RNAi及含IFN+PP的CM对LLC的增殖有一定抑制作用（分别P＜0.01**、P＜0.01**和P＜0.001***）;含IL-6和含IL-6+PP+RNAi的CM对LLC的增殖有一定促进作用（都是P＜0.001***）;含IL-4+PP+RNAi的CM对LLC的增殖有一定促进作用（P＜0.01**）。在48h作用时间下,与空白RAW264.7巨噬细胞CM相比,含PP的CM对LLC的增殖没有影响（P＞0.05）,而含IFN、含IFN+PP+RNAi及含IFN+PP的CM对LLC的增殖有一定抑制作用（分别P＜0.01**、P＜0.001**和P＜0.001***）;含IL-6和含IL-6+PP+RNAi的CM对LLC的增殖有一定促进作用（都是P＜0.001***）;含IL-4+PP的CM对LLC的增殖有一定抑制作用（P＜0.01**）。在72h作用时间下,与空白RAW264.7巨噬细胞CM相比,含PP的CM对LLC的增殖没有影响（P＞0.05）,而含IFN、含IFN+PP+RNAi及含IFN+PP的CM对LLC的增殖有一定抑制作用（分别P＜0.01**、P＜0.01**和P＜0.001***）;含IL-6和含IL-6+PP+RNAi的CM对LLC的增殖有一定促进作用（都是P＜0.001***）;含IL-4+PP+RNAi的CM对LLC的增殖有一定促进作用（P＜0.01**）。（4）在24h作用时间下,与空白thp-1巨噬细胞条件培养基（CM）相比,含PP的CM对A549的增殖有一定促进作用（P＜0.001***）,而含IFN、含IFN+PP+RNAi及含IFN+PP的CM对A549的增殖有一定抑制作用（分别为P＜0.01**,P＜0.001***,P＜0.001***）;含IL-6和含IL-6+PP+RNAi的CM对A549的增殖有一定促进作用（都是P＜0.001***）;含IL-4+PP的CM对A549的增殖有一定抑制作用（P＜0.001**）。在48h作用时间下,与空白thp-1巨噬细胞CM相比,含PP的CM对A549的增殖没有影响（P＞0.05）,而含IFN、含IFN+PP+RNAi及含IFN+PP的CM对A549的增殖有一定抑制作用（分别P＜0.01**、P＜0.001**和P＜0.001***）;含IL-6、IL-6+PP和含IL-6+PP+RNAi的CM对A549的增殖有一定促进作用（分别为P＜0.001***,P＜0.01**,P＜0.001***）;含IL-4+PP+RNAi的CM对LLC的增殖有一定促进作用（P＜0.001***）。在72h作用时间下,与空白thp-1巨噬细胞CM相比,含PP的CM对A549的增殖没有影响（P＞0.05）,而含IFN、含IFN+PP+RNAi及含IFN+PP的CM对A549的增殖有一定抑制作用（都是P＜0.001***）;含IL-6和含IL-6+PP+RNAi的CM对A549的增殖有一定促进作用（都是P＜0.001***）;含IL-4的CM对A549的增殖有一定促进作用（P＜0.01**）。3.细胞凋亡:2μM的PP对RAW细胞的凋亡没有影响（P＞0.05）,1μM的PP对THP-1细胞的凋亡没有影响（P＞0.05）,2μM的PP和不同细胞因子作用的条件培养基对LLC细胞的凋亡没有影响（P＞0.05）,1μM的PP和不同细胞因子作用的条件培养基对A549细胞的凋亡没有生物学意义。4.Western Blot结果表明:（1）2μM的重楼皂苷可以促进IFNγ诱导的巨噬细胞M1极化,和抑制IL4诱导的巨噬细胞M2极化。这种作用不依赖于JAK/STAT1和JAK/STAT6通路。（2）IL-6诱导下的M2巨噬细胞培养基可以抑制LLC肺癌细胞上皮标志蛋白E-Cadherin的表达,2μM的重楼皂苷可以逆转这种抑制作用;IL-6诱导下的M2巨噬细胞培养基可以促进LLC肺癌细胞间质标志蛋白Vimentin的表达,而重楼皂苷可以逆转这种促进作用。5.PCR结果表明（1）不同作用时间PP对M1巨噬细胞基因i NOS表达都有促进作用。3h和3h+PP相比差异具有统计学意义（p＜0.05）,6h和6h+PP相比,差异具有统计学意义（p＜0.01）,12h和12h+PP相比,差异具有统计学意义(p＜0.01。（2）不同作用时间PP对M2巨噬细胞基因Arg-1表达的影响。4h和4h+PP相比差异具有统计学意义（p＜0.05）,8h和8h+PP相比,差异具有统计学意义（p＜0.01）,16h和16h+PP相比,差异具有统计学意义（p＜0.01）。6.Transwell实验结果表明:PP单独作用的培养基对LLC细胞迁移运动能力没有影响,M2培养基可以显著促进LLC的迁移运动,PP可以抑制M2条件培养基对LLC迁移运动的促进作用。7.免疫荧光实验结果表明:IFN-γ刺激下的巨噬细胞高表达i NOS,PP可以进一步强化这种促进作用。结论1.经细胞实验研究结果证实,PP可以在体外诱导的RAW264.7巨噬细胞M1/M2极化模型中起到促进M1型、抑制M2型极化的作用。2.PP在体外通过促进M1巨噬细胞极化,抑制M2巨噬细胞极化抑制肿瘤的生长和转移,这种作用可能与EMT有关。