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目的:研究高三尖杉酯碱(Homoharringtonine, HHT)对多发性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)细胞的杀伤作用及对Mcl-1的影响。 方法:不同浓度的HHT作用于RPMI8226细胞后用CCK-8法、台盼蓝染色法与集落形成实验等检测细胞的增殖抑制能力;HHT(40ng/ml)作用于与HS-5细胞共培养后的RPMI8226细胞12h和24h后用annexinV-PE/7AAD双染流式细胞术检测细胞凋亡情况;HHT(40ng/ml)作用于 RPMI8226细胞后用流式细胞术检测线粒体膜电位变化;用流式细胞术检测与 HS-5细胞共培养前后的RPMI8226细胞的细胞周期分布;HHT(40ng/ml)作用于与HS-5细胞共培养前后的 RPMI8226细胞后用 Western blot方法检测细胞中的蛋白 p-AktThr308、p-AktSer473、Mcl-1、Bcl-2、PARP、Caspase3与Caspase9表达水平变化;用RT-qPCR检测与 HS-5细胞共培养前后的 RPMI8226细胞及 HHT(40ng/ml)作用后的RPMI8226细胞中mcl-1基因mRNA含量变化;用放线菌酮实验与蛋白酶体抑制剂实验探讨HHT(40ng/ml)作用于RPMI8226细胞后对细胞中的Mcl-1蛋白的降解作用。 结果: 1.与HS-5细胞共培养后的RPMI8226细胞(共培养后的RPMI8226细胞)周期分布和生长速度发生改变,与单独培养的RPMI8226细胞相比,共培养后的RPMI8226细胞G1期升高了9%,S期减少12%,生长速度减慢。 2.HHT可显著抑制RPMI8226细胞的增殖,并呈剂量依赖性和作用时间依赖性;对共培养后的RPMI8226细胞也有杀伤作用,但敏感性下降,如用20ng/ml HHT作用24h,对单独培养和共培养后的 RPMI8226细胞的抑制率分别为63%和31%,下降了32%。HHT处理后的RPMI8226细胞集落形成能力减弱,随着药物浓度的增加,集落数量递减、体积变小。 3.HHT可诱导RPMI8226细胞发生凋亡,作用12h和24h时,共培养后的RPMI8226细胞凋亡率分别为(11.16±0.78)%与(23.39±0.86)%;作用24h后,共培养后的RPMI8226细胞线粒体膜电位下降细胞的比例为(19.20±0.91)%。用WB法检测蛋白变化,可见PARP、Caspase3和Caspase9出现明显的剪切体,Mcl-1蛋白明显下调,Bcl-2蛋白无变化。 4.HHT对MM原代细胞也具有明显的杀伤抑制效果,随着HHT药物浓度增大和作用时间延长,抑制率也随之增高;流式细胞术显示HHT作用于原代MM细胞后细胞发生了明显的凋亡;HHT处理后的MM原代中Mcl-1蛋白明显减少, Bcl-2没有明显变化。 5.共培养后,RPMI8226细胞中的p-AktT308和p-AktS473有不同程度的上调, Akt特异性抑制剂LY294002作用6h后,RPMI8226细胞内的p-AktS473表达开始减弱。与HHT单独作用相比,LY294002与HHT联合作用对共培养后的RPMI8226细胞的增殖抑制率以及蛋白下调幅度明显提高。说明 PI3K/Akt信号通路参与了共培养后的 RPMI8226细胞对HHT敏感性降低的过程。 6.共培养后RPMI8226细胞中的Mcl-1蛋白明显上调,HHT作用后RPMI8226细胞中 Mcl-1蛋白明显下调, mRNA水平没有发生明显改变。共培养后的RPMI8226细胞中Mcl-1蛋白的上调与HHT作用后Mcl-1蛋白的下调都是发生在翻译水平。放线菌酮实验与蛋白酶体抑制实验表明HHT能加速RPMI8226细胞中的Mcl-1蛋白降解。 结论:HHT能诱导多发性骨髓瘤细胞发生凋亡并且能显著下调 Mcl-1蛋白的表达。