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猪囊孢球虫(Cystoisospora suis)、隐孢子虫(Cryptosporidium)、毕氏肠微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi)常经粪口途径传播,流行范围广泛且危害严重。不仅给我国畜牧业造成了极大的经济损失,而且Cryptosporidium和E.bieneusi为人兽共患原虫,亦威胁到社会公共卫生安全。现仅有猪囊孢球虫(Cystoisospora suis)1个种被公认为是猪的囊孢属球虫,而且普遍认为该病原能够引发猪球虫病。且对于不同品种不同生长阶段的猪都可以感染,以糊状到水样的非出血性腹泻和明显的体重减轻为主要症状,其中对哺乳及断奶仔猪的危害最为严重,治疗不及时会导致僵猪或死亡。Cryptosporidium感染人和动物胃肠道后,通常表现为急、慢性腹泻,尤其对免疫缺陷综合症患者会引起白限性腹泻,严重者可导致死亡。一般情况下,感染E.bieneusi后,其患者/牲畜不会出现明显的临床症状,但HIV患者和免疫功能低下的儿童感染后经常会出现持续性腹泻并伴有发热、食欲下降和体重减轻等症状。仔猪感染E.bieneusi可导致吸收不良从而影响其生长发育。目前,针对这三种病原的检测主要是常规PCR方法,但在用该种方法进行一次PCR扩增时,只能检测出一种病原,在临床应用中费时费力。迄今为止,还没有关于同时检测Cystoisospora suis与Cryptosporidium/E.bieneusi的双重nest-PCR检测方法。因此,本研究旨在建立能够高效快速的同时检测Cystoisospora suis 与 Cryptosporidium/E.bieneusi的双重 nest-PCR 检测方法,为猪场检测这三种肠道病原提供技术手段。1.猪囊孢球虫和毕氏肠微孢子虫双重巢式PCR检测方法的建立与初步应用参考文献引物,基于Cystoisospora suis SSU rRNA和E.bieneusi ITS基因序列,首先进行检测两病原的双重nest-PCR反应体系和反应条件优化,及特异性、敏感性、重复性试验和临床样品检测。结果显示,该方法两轮退火温度分别确定为57℃和55℃,且在Cystoisospora suis/E.bieneusi引物量的比为0.25/1.0 μL时能特异性扩增Cystoisospora suis(530 bp)和E.bieneusi(392 bp),而 C.andersoni、G.duodenalis、Blastocystis、E.coli等无交叉感染现象,特异性良好;Cystoisospora suis和E.bieneuis的DNA最低稀释倍数分别为1×10-5和1×10-7,即最低DNA检测量分别为209×10-5 ng/μL和 527×10-7 ng/μL;且重复性试验良好。此外,分别应用单病原nest-PCR方法和双重nest-PCR对48份猪粪便DNA样品进行Cystoisospora suis与E.bieneusi扩增,结果表明,单病原nest-PCR和双重nest-PCR对Cystoisospora suis和E.bieneusi的检测结果差异不显著(P>0.05)。因此,本研究建立的可同时诊断出Cystoisospora suis和E.bieneusi的双重nest-PCR方法,不仅为猪场这两种肠道原虫病的诊断提供了技术手段,而且对防控该两种肠道原虫病具有重要意义。2.猪囊孢球虫和隐孢子虫双重巢式PCR检测方法的建立与初步应用参考文献引物,基于Cystoisospora suis与Cryptosporidium的SSU rRNA基因位点建立检测两病原的双重nest-PCR方法。首先对反应体系及条件的各项主要参数进行优化,并对建立的方法进行特异性、敏感性、重复性试验及临床样品检测,成功建立了Cystoisospora suis和Cryptosporidium双重nest-PCR方法。结果显示,退火温度最终确定为55℃,且在Cystoisospora suis/Cryptosporidium引物量的比为0.25/1.0μL时,所建立的Cystoisosapor suis与Cryptosporidium双重nest-PCR方法能分别扩增出530 bp和840 bp的特异性条带,且与E bieneusi,G.duodenalis、E.coli未出现交叉感染现象,特异性良好;Cystoisosporasuis和Cryptosporidium的DNA最低稀释倍数分别为1×10-4和1 ×10-3;即最低检测量分别为80.6×10-4 ng/μL和9.8×10-3 ng/μL;且重复性良好。用本试验建立的双重nest-PCR方法对62份猪粪便DNA样品进行Cystoisospora suis与Cryptosporidium扩增,结果显示,单病原nest-PCR和双重nest-PCR对Cystoisospora suis与Cryptosporidium检测结果无显著差异(P>0.05)。表明建立的Cystoisospora suis与Cryptosporidium双重nest-PCR方法可用于临床样品检测。