进入21世纪以来,船舶、港口建设、风力发电场、石油和地质勘探等海洋活动所产生的噪声持续增长,并已成为海洋中不可忽视的污染源。然而,大多数研究只关注海洋哺乳动物和鱼类,对软体动物的研究的少之又少,这没有反映出它们在海洋生态系统中重要性。许多软体动物具有相对较小的体积,生命周期短,易于在实验室和现场条件下进行研究,并且较脊椎动物对低频声音更敏感,因此是探究低频噪声影响的最佳材料。因此,本文以瘤背石磺为研究对象,以行为学、生理学和分子生物学等技术方法,研究低频噪声和其它环境压力源（病菌和重金属）双重暴露下瘤背石磺行为、生化反应、抗氧化指标以及免疫指标的变化,揭示低频噪声对瘤背石磺行为、氧化应激和免疫防御的影响。同时结合转录组学,全面的阐述了低频噪声对瘤背石磺造成的潜在的胁迫响应分子机制,为海洋噪声污染在软体动物方面的研究提供理论依据。试验一:低频噪声对瘤背石磺行为和生理的影响沿海工业建设和水上运输业产生的大量海洋噪声污染影响了海洋生物的生长和发展,这是威胁海洋生物的一个大问题。然而,大多数研究都集中在脊椎动物,如海洋哺乳动物和鱼类,而噪声对海洋无脊椎动物的影响知之甚少。因此,我们研究了低频噪声对瘤背石磺行为和生理反应的影响。在实验室条件下,用100、300和500Hz的低频噪声刺激瘤背石磺1 h,然后测量血淋巴中葡萄糖（Glu）、白蛋白（ALB）、甘油三酯（TG）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和丙二醛（MDA）酶活性,并通过实时定量聚合酶链反应（q RT-PCR）分析检测血淋巴和神经系统中Hsp70基因的m RNA表达,同时用免疫组化法分析Hsp70蛋白的表达。结果表明,与对照组相比,瘤背石磺在低频噪声的胁迫下表现处远离刺激源的行为。在低频噪声的影响下,血淋巴中葡萄糖、白蛋白、甘油三酯、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和丙二醛等酶的活性显著高于对照组（P＜0.05）,相对于对照组,血淋巴和中枢神经系统中Hsp70基因m RNA表达量显著升高（P＜0.05）,中枢神经系统中Hsp70蛋白的表达水平也显著高于对照组（P＜0.05）。总的来说,这些变化表明,低频噪声可以引起瘤背石磺体内的氧化应激,而且当噪声频率从100 Hz增加到500 Hz时,氧化损伤逐渐增加。试验二:暴露于低频噪音下瘤背石磺中枢神经系统的转录组分析低频噪音已成为当今一种不可忽视的海洋污染物,但多数研究主要集中于对海洋脊椎动物的行为和生理造成的影响,而在海洋软体动物中研究较少。故本试验采用Sea slug为研究对象,探究低频噪音对其生理方面的影响。本试验设计不同低频噪音（0、100、300、500 Hz）和不同刺激时间（0、6、12 h）,测定血淋巴中的SOD、CAT、MDA活性以及对照组（C）和500 Hz噪音中6 h、12 h组（L1和L2）转录组学。结果显示抗氧化酶的活性与低频噪音频率呈正相关（P＜0.05）,与时间无相关性（P＞0.05）。在中枢神经系统转录组学方面,与C组相比,L1和L2组分别有2460、3268个基因上调和2765、2783个基因下调。根据KEGG分析,低频噪音主要影响Cytokine-cytokine receptor interaction、Fox O signaling pathway等信号传导通路,Natural killer cell mediated cytotoxicity、Apoptosis等免疫相关通路,Glycolysis、TCA cycle、Glycerophospholipid metabolism等能量代谢通路以及GABAergic synapse、Synaptic vesicle cycle、Amyotrophic lateral sclerosis（ALS）等神经系统通路。本研究对低频噪音胁迫的潜在响应研究提供了有价值的参考资料。试验三:低频噪声对瘤背石磺血细胞和肝胰腺免疫指标的影响血细胞和肝胰腺在贝类非特异性免疫中发挥着重要的作用。然而,目前关于低频噪声对海洋动物免疫系统的研究少之又少。因此,本研究为了探究低频噪声对瘤背石磺免疫系统的影响。我们以瘤背石磺为实验对象,在1000 Hz的低频噪声中分别进行了1、3、6和12 h的暴露实验,检测血细胞的ROS产量和细胞活力以及肝胰腺中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）和谷胱甘肽-S转移酶（GST）等抗氧化酶和免疫相关基因人核因子κB抑制蛋白α（IκBα）、转录因子p65（p65）、Bcl-2相关蛋白x（Bax）、B细胞淋巴瘤2（bcl-2）、白细胞介素-8（IL-8）、白细胞介素-1β（IL-1β）和Toll样受体4（TLR4）的m RNA表达量。结果显示,相较于未暴露组,瘤背石磺血细胞ROS产量显著升高（P＜0.05）,细胞活力显著下降（P＜0.05）;并且肝胰腺中SOD、CAT、GSH-PX和GST抗氧化酶活性出现不同程度的升高（P＜0.05）,免疫相关基因IκBα、p65、Bax、bcl-2、IL-8、IL-1β和TLR4基因的m RNA表达量也出现不同程度的增加（P＜0.05）。而且以上指标的变化量与暴露时间呈正相关（P＜0.05）。综合以上结果,表明低频噪声可以引起瘤背石磺产生氧化应激和免疫反应。试验四:低频噪声对感染副溶血性弧菌瘤背石磺成活率和免疫力的影响海洋噪声已成为一种影响海洋动物行为、生理和免疫的重要环境污染物。然而,在噪声的影响下,海洋动物对病菌的抵抗力却一直未被重视。为了考察瘤背石磺暴露在低频噪声中对病菌的免疫防御反应,我们对副溶血性弧菌攻毒后的瘤背石磺,在500 Hz和1000 Hz的低频噪声中进行120 h的暴露实验。结果显示,副溶血性弧菌攻毒后,瘤背石磺的存活率下降,血细胞的凋亡率和ROS产量显著升高,血细胞增殖加快,肝胰腺中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、碱性磷酸酶（AKP）、谷丙转氨酶（ALT）、溶菌酶（LZM）等酶活性显著上升（P＜0.05）,TNF信号通路相关基因（TNF-α、FADD、Caspase 8、Caspase 3）和热休克蛋白70（Hsp70）基因的表达也普遍上调（P＜0.05）。此外,将感染副溶血性弧菌的瘤背石磺暴露在500 Hz和1000 Hz的低频噪声后,上述指标均显著升高（P＜0.05）,且与频率呈正相关（P＜0.05）。对低频噪声频率和暴露时间进行双因素方差分析结果显示,噪声频率和暴露时间对以上指标有交互作用。综上所述,低频噪声暴露增加了瘤背石磺对病菌的感染风险,加剧了对机体抗氧化能力和免疫代谢的负面影响。试验五:低频噪声加重了瘤背石磺的镉富集及毒性镉已成为一种影响海洋动物行为、生理和免疫的重要环境污染物。在镉污染日益严重的情况下,海洋中也产生了越来越多的噪声污染。然而,人为噪声和镉污染同时存在时对海洋生物的生理反应尚不清楚。为了考察瘤背石磺同时暴露在低频噪声和镉中的免疫防御反应,我们将处在镉环境的瘤背石磺,在500 Hz和1000 Hz的低频噪声中进行120 h的暴露实验。结果显示,单独暴露在镉环境后,瘤背石磺肝胰腺中Cd2+的浓度上升（P＜0.05）,血细胞的凋亡率和ROS产量显著升高（P＜0.05）,血细胞增殖加快（P＜0.05）,肝胰腺中总抗氧能力（TAC）活性显著降低（P＜0.05）,还原型谷胱甘肽酶（GSH）、脂质过氧化物（LPO）和谷草转氨酶（ALT）酶活性显著上升（P＜0.05）,p53信号通路相关基因（p53、Cyt C、Caspase 3和Caspase 9）和金属硫蛋白（MT）、热休克蛋白70（Hsp70）基因的表达也普遍上调（P＜0.05）。此外,将瘤背石磺同时暴露在镉和500 Hz、1000 Hz的低频噪声后,上述指标均显著升高（P＜0.05）,且与频率呈正相关（P＜0.05）。对低频噪声频率和暴露时间进行双因素方差分析结果显示,噪声频率和暴露时间对以上指标有交互作用。综上所述,低频噪声暴露增加了瘤背石磺对Cd2+的富集,加剧了对机体抗氧化能力和免疫代谢的负面影响。试验六:瘤背石磺转录因子HSF1的克隆、鉴定及与Hsp70表达的相关性热休克转录因子1（HSF1）被认为在环境干扰以及蛋白质毒性应激下,能够激活Hsp70转录以达到保护细胞的目的。在海洋脊椎动物中,HSF1已得到广泛的研究,然而对软体动物的研究非常少,尤其是在环境因子的胁迫下,HSF1与Hsp70之间的调控关系尚不清楚。因此,在本研究中,我们探究了瘤背石磺暴露在低频噪声下,HSF1在Hsp70表达过程中发挥的功能作用。我们首次克隆得到长1572 bp的瘤背石磺Or HSF1基因序列,其中,编码区长819 bp,编码273个氨基酸。系统进化树结果显示,瘤背石磺HSF1与加州海兔（Aplysia californica）、光滑双脐螺（Biomphalaria glabrata）和截形小泡螺（Bulinus truncatus）等软体动物同源性较高。在将Or HSF1基因进行RNA干扰后,发现基因沉默效应在瘤背石磺中枢神经系统、肝胰腺、肠、生殖腺、肌肉、腹足和血淋巴中具有系统性。在RNA干扰实验进行的5 d内,Or HSF1基因m RNA表达量呈先下降后上升的趋势,表明基因沉默效应具有持续性,而且Or HSF1基因与Hsp70的表达模式具有统一性。将RNA干扰后的瘤背石磺暴露在500 Hz的低频噪声中6 h后,中枢神经系统中Hsp70的m RNA表达量和蛋白表达量相对于噪声组均有显著的下降（P＜0.05）,但高于对照组（P＜0.05）,表明HSF1对瘤背石磺Hsp70的表达具有调控作用,而且初步揭示了HSF1-Hsp70调控轴参与瘤背石磺的应激反应。