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鮸鱼（Miichthys miiuy）作为一种重要的海洋经济鱼类,主要分布在日本西部海域到中国东部沿海。自1990年代后期以来,由于鮸鱼在商业上具有重要的应用价值,其养殖规模得到了大的发展。然而,鮸鱼在人工养殖条件下,经常会发生由多种病原引发的病害,尤其在鮸鱼的幼鱼中会发生许多寄生虫和细菌性疾病,这些病害的发生给鮸鱼的商业化生产造成了严重的威胁。因此,提高鮸鱼的抗病能力是增加鮸鱼养殖产量的重要途径之一。在本文的研究中,通过使用革兰氏阴性菌（鳗弧菌和哈维氏弧菌）感染以及脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS）刺激鮸鱼,旨在研究鮸鱼抵抗微生物病原体的免疫反应机制,以探索增强鮸鱼抵抗病原体的途径和方法,从而为鱼类防御微生物病原体的感染提供一定的理论依据。先天性免疫是机体抵抗外源微生物病原体感染的第一道防御机制。当宿主受到外源微生物病原体的感染时,刺激机体产生一系列炎症细胞因子,从而引发宿主激活免疫反应。Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）是参与宿主先天性和适应性免疫应答过程中的一类重要的模式识别受体（Pattern recognition receptors,PRRs）,其通过识别各种病原体的相关分子模式（pathogen associated molecular patterns,PAMPs）进行免疫反应。在TLR介导的信号通路中,主要通过髓样分化因子88（Myeloid differentiation factor 88,My D88）依赖性信号通路进行信号转导,并且在该信号通路转导过程中,有很多重要的信号蛋白,参与调控机体的免疫反应。这些下游的信号分子,主要包括转化生长因子β活化激酶1（Transforming growth factor-β-activated kinase 1,TAK1）、TAK1结合蛋白1（TAK1-binding protein 1,TAB1）和肿瘤坏死因子受体相关因子6（Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6）等,从而引起核转录因子-κB（Nuclear transcription factor-κB,NF-κB）的激活,触发炎症细胞因子的产生,以抵御外源病原体的入侵。micro RNA（mi RNA）是一类长度为18～22 nt,非编码并且高度保守的单链小分子RNA。mi RNA参与调控基因的表达,通过与靶基因m RNA的3’端非翻译区（3’-untranslated region,3’-UTR）以碱基互补配对的方式结合,导致蛋白质的翻译被抑制和（或）m RNA的表达量被降解。到目前为止,大量的mi RNA已被发现能够作为调控因子参与调控哺乳动物的免疫反应。近年来研究发现,mi RNA在调控鱼类复杂的免疫调控网络中也具有重要的作用。在本研究中,对mi RNA调控TLR信号通路中不同的信号分子进行研究,旨在发现参与调控这些重要信号分子的mi RNAs,为鱼类mi RNA进一步功能上的研究和开发鱼类抗病疫苗来促进渔业发展提供理论依据。因此,探究能够参与调控TRFA6、TAK1和TAB1相关的mi RNA具有重要的意义。具体的研究结果如下:1.mi R-20-1和mi R-101a靶向TRAF6抑制炎症反应的机制研究TRAF6被证实为关键的信号分子,并且其已被阐明是哺乳动物中TLR信号通路介导免疫反应的主要参与者。在本研究中,mi R-20-1和mi R-101a,这两种mi RNA被证实为参与病原体感染硬骨鱼免疫炎症反应的负调控因子。首先,通过实时荧光定量PCR实验,实验结果发现在LPS刺激和革兰氏阴性菌（哈维氏弧菌）感染后,mi R-20-1和mi R-101a的表达量均显著增加。然后利用生物信息学预测软件和双荧光素酶报告基因检测系统验证,证实mi R-20-1和mi R-101a能够靶向TRAF63’-UTR。利用实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹实验,证实mi R-20-1和mi R-101a可以通过抑制TRAF6 m RNA的稳定性,从而负向调控TRAF6的蛋白表达。随后证实了过表达的mi R-20-1和mi R-101a可以作为负调控因子,参与调节炎症细胞因子的产生。通过进一步实验,阐明mi R-20-1和mi R-101a可以抑制TRAF6介导的TLR信号通路。最后,研究发现在大黄鱼中mi R-20-1和mi R-101a也能够靶向调控TRAF6基因,这充分证实了本研究的广泛性。总的来说,这些数据表明mi R-20-1和mi R-101a能够作为负调控因子,通过靶向TRAF6抑制LPS诱导的炎症细胞因子的产生,负向参与调控TRAF6介导的TLR信号通路,使机体避免过度的免疫和炎症反应。2.mi R-144和mi R-20-1靶向TAB1抑制炎症反应的机制研究TAB1已被证实为哺乳动物TLR信号通路中介导免疫应答的重要蛋白激酶。在这项研究中,报道了两种mi RNA,mi R-144和mi R-20-1被证实为参与病原体感染硬骨鱼免疫炎症反应的负调控因子。首先,通过实时荧光定量PCR实验,研究发现在革兰氏阴性菌（鳗弧菌）感染后,mi R-144和mi R-20-1的表达量均显著增加。然后利用生物信息学预测软件和双荧光素酶报告基因检测系统验证,证实mi R-144和mi R-20-1能够靶向TAB1 3’-UTR。利用实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹实验,证实mi R-144和mi R-20-1可以通过抑制TAB1 m RNA的稳定性,从而负向调控TAB1的蛋白表达。通过进一步实验,阐明mi R-144和mi R-20-1可以抑制TAB1介导的TLR信号通路。最后,研究发现在美国红鱼和双棘黄姑鱼中mi R-144和mi R-20-1也能够靶向调控TAB1基因,这充分证实了本研究的广泛性。总的来说,这些数据表明,mi R-144和mi R-20-1能够作为负调控因子,通过靶向TAB1抑制LPS诱导的炎症细胞因子的产生,负向调控TAB1介导的TLR信号通路,使机体避免过度的免疫炎症反应。3.mi R-132靶向TRAF6、TAK1和TAB1抑制炎症细胞因子产生的机制研究TRAF6、TAK1和TAB1均已被证实为哺乳动物中TLR信号通路介导免疫反应的重要蛋白分子激酶。在本研究中,发现mi R-132在参与病原体感染硬骨鱼免疫炎症反应中起负调控作用。首先,通过实时荧光定量PCR实验,研究发现,mi R-132的表达量在革兰氏阴性菌（哈维氏弧菌）感染和LPS刺激后均显著增加。然后利用生物信息学预测软件和双荧光素酶报告基因检测系统验证,证实mi R-132能够靶向TRAF6、TAK1和TAB1 3’-UTR。利用实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹实验,证实mi R-132可以通过抑制TRAF6、TAK1和TAB1 m RNA的稳定性,从而负向调控TRAF6、TAK1和TAB1的蛋白表达。随后证实了过表达的mi R-132可以作为负性调控因子,参与调节免疫炎症细胞因子的产生。通过进一步实验,阐明mi R-132可以抑制TRAF6、TAK1和TAB1介导的TLR信号通路。最后,研究发现在大黄鱼中mi R-132也能够靶向调控TRAF6、TAK1和TAB1基因,这充分证实了本研究的广泛性。总的来说,这些数据表明,mi R-132能够作为负调控因子,通过靶向TRAF6、TAK1和TAB1抑制LPS诱导的炎症因子的产生,负向调控TRAF6、TAK1和TAB1介导的TLR信号通路,使机体避免过度的免疫炎症反应。