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背景弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者经R-CHOP一线化疗方案治疗后,多数病情可以得到部分或完全缓解,但仍有40%的患者在这一治疗后进展为复发或难治性淋巴瘤。课题组既往研究发现肿瘤微环境（TME）中的IL-6会导致患者在接受利妥昔单抗治疗后出现化疗耐药,抑制淋巴瘤细胞自发或药物诱导的细胞凋亡,而这些作用可以被抗IL-6抗体所抑制。关注TME中的促癌因素将有助于治疗DLBCL。间充质干细胞（MSCs）具有向肿瘤细胞迁移并定植的能力,在临床前及临床研究中被广泛用作为抗肿瘤药物细胞载体。综合前期研究结果及GEO数据库筛选DLBCL肿瘤微环境中影响患者预后的差异表达基因（DEGs）,本研究设计构建能够表达串联双抗（Tandab）的脐带间充质干细胞（UCMSCs）,研究其双抗分泌特性及其对DLBCL细胞生长的抑制作用。方法1.通过GEO数据库下载含DLBCL的数据集,筛选含有生存信息的样本,进行后续TME相关研究。使用ESTIMATE算法计算每个样本的免疫评分和基质评分,估算样本中免疫和基质成分的含量。使用Kaplan-Meier生存分析评估评分与患者生存的关系。Wilcoxon和Kruskal-Wallis秩和检验验证评分与患者临床特征的关系。根据免疫及基质评分的中位值,筛选肿瘤微环境相关DEGs。通过GO、KEGG富集分析探索这些DEGs潜在的分子机制和生物学功能。通过单因素Cox回归分析从这些DEGs中筛选与DLBCL预后相关的关键基因。对关键基因进行生存分析验证。2.设计并构建编码IL-6抗体及CD20抗体基因的Tandab质粒,通过Tandab质粒和病毒包装辅助质粒（p CMV-VSVG、ps PAX2）包装Tandab慢病毒。Tandab慢病毒用于转导UCMSCs以构建UCMSCs-Tandab（IL-6/CD20）细胞株。含嘌呤霉素的培养基筛选UCMSCs-Tandab（IL-6/CD20）稳转株。构建UCMSCs-Vector细胞株作为对照组。3.流式细胞术鉴定转染后UCMSCs-Tandab（IL-6/CD20）和UCMSCs-Vector表面CD34、CD90和CD105的表达。CCK-8、凋亡实验、划痕实验和Transwell迁移实验用于检测UCMSCs在转染Tandab慢病毒后是否影响细胞的增殖和迁移能力。通过q RT-PCR、Western blot、免疫荧光等实验验证UCMSCs-Tandab（IL-6/CD20）是否成功构建并表达目标Tandab蛋白。ELISA检测UCMSCs-Tandab（IL-6/CD20）随不同天数Tandab蛋白的分泌量。4.细胞结合实验（免疫荧光、流式细胞术）用于鉴定UCMSCs-Tandab（IL-6/CD20）分泌的Tandab蛋白能否与CD20阳性的DLBCL细胞（SU-DHL-2和SU-DHL-4）结合。将淋巴瘤细胞与UCMSCs-Tandab（IL-6/CD20）共培养,CCK-8、效靶比和EDU实验检测UCMSCs-Tandab（IL-6/CD20）对SU-DHL-2和SU-DHL-4细胞活力和增殖的抑制情况。结果1.GEO数据库下载得到GSE181063数据集,从中筛选到含生存数据的DLBCL病例共1037例。通过ESTIMATE算法得到了每个DLBCL患者与肿瘤微环境相关的评分。Kaplan-Meier生存分析结果提示高免疫和高基质评分的患者预后更好（P＜0.001）。临床相关性分析表明DLBCL患者的年龄、分子亚型、分期和结外肿瘤转移数目均与评分有关。GO和KEGG富集分析提示DEGs主要富集在免疫相关的信号通路。单因素Cox回归分析筛选得到150个与DLBCL患者预后显著相关的基因,包括IL6、CD3E、CD6、CD8A、CD2、AMICA1等（P＜0.05）。IL6基因生存分析结果表明IL6高表达不利于DLBCL患者的生存。2.显微镜观察UCMSCs-Tandab（IL-6/CD20）和UCMSCs-Vector的细胞形态呈纺锤形,细胞贴壁生长。荧光显微镜下发现UCMSCs-Tandab（IL-6/CD20）和UCMSCs-Vector均表现出自发的绿色荧光,表明转基因稳转株筛选成功。3.流式检测表面标志物结果提示UCMSCs-Tandab（IL-6/CD20）、UCMSCs-Vector、UCMSCs均表达CD90和CD105（阳性率大于90%）,三种细胞株均不表达CD34。CCK-8、凋亡实验、划痕实验和Transwell迁移实验表明在经慢病毒转染后UCMSCs的增殖和迁移能力没有下降。q RT-PCR实验表明相比对照组,UCMSCs-Tandab（IL-6/CD20）组中Tandab m RNA表达高达1×10~7倍。Western blot结果表明UCMSCs-Tandab（IL-6/CD20）的培养上清液及细胞裂解液中都含有His Tag标记的Tandab蛋白。免疫荧光结果提示,在抗His Tag抗体孵育后UCMSCs-Tandab（IL-6/CD20）组可以表现出相应的红色荧光。ELISA结果发现UCMSCs-Tandab（IL-6/CD20）可以持续分泌Tandab蛋白至少30天,在培养第7天时,分泌水平最高,可以达到6273±487 pg/ml。4.免疫荧光及流式结果表明Tandab蛋白可以与CD20阳性的淋巴瘤细胞结合。CCK-8实验验证了UCMSCs-Tandab（IL-6/CD20）培养上清液抑制SU-DHL-2和SU-DHL-4细胞的生长。效靶比实验表明随着效应细胞与肿瘤细胞比例的提高,UCMSCs-Tandab（IL-6/CD20）对淋巴瘤细胞的抑制效果更加明显。EDU实验进一步验证了UCMSCs-Tandab（IL-6/CD20）对SU-DHL-2和SU-DHL-4的增殖抑制效果。结论1.肿瘤微环境中的免疫及基质成分与DLBCL患者总生存期、年龄、分子亚型、分期和结外肿瘤转移数目显著相关。IL6基因表达水平与DLBCL患者总生存期呈负相关关系。2.成功构建转基因细胞产物UCMSCs-Tandab（IL-6/CD20）。3.转基因操作不影响细胞的表型、增殖及迁移能力。UCMSCs-Tandab（IL-6/CD20）可以稳定持续分泌Tandab蛋白。4.Tandab蛋白可以与CD20阳性的DLBCL细胞（SU-DHL-2和SU-DHL-4）结合。UCMSCs-Tandab（IL-6/CD20）对DLBCL细胞的增殖具有抑制作用。