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第一部分 Par-4基因在新生大鼠缺氧缺血后不同部位脑组织中的表达与作用 目的： 研究Par-4基因在新生大鼠缺氧缺血后不同部位脑组织中的表达与作用 方法： (1)构建新生大鼠缺氧缺血性脑病(HIE)动物模型。实验动物分成HIE模型组、假手术组和正常对照组。 (2)Rt-PCR测定大脑额叶皮质、海马组织、小脑和下丘脑组织中Par-4 mRNA水平。 (3)Western blot检测海马组织中Par-4蛋白表达量。 (4)比色法检测海马组织中Caspase-3活性。 结果： 1、HIE模型组的各部分脑组织在2h、6h、12h、24h各时间点的Par-4mRNA水平都显著高于假手术组和正常对照组(P＜0.05)，并都在6h达到高峰(P＜0.05)。 2、HIE模型组内，在缺氧缺血6小时时间点，以海马组织中Par-4mRNA水平最高，其次为大脑额叶皮质和小脑，下丘脑中水平最低，组内比较P＜0.05，有显著性差异。 3、HIE模型组的海马组织在12小时、24小时、36小时、48小时、72小时不同时间点，Par-4蛋白量都高于假手术组和正常对照组(P＜0.05)，并在24h达到高峰(P＜0.05)。 4、HIE模型组海马组织，在12小时、24小时、36小时、48小时、72小时不同时间点，Caspase-3活性都高于假手术组和正常对照组，(P＜0.05)，并在24h达到高峰(P＜0.05)。 5、HIE模型组内，Par-4蛋白表达量与Caspase-3活性呈显著正相关(r=0.622，P＜0.05)。南京医科大学硕士学位论文结论:(1)、首次发现缺氧缺血对新生大鼠脑组织的损害作用，可能涉及到Par一4基因的表达。(2)、Par一4基因在不同脑组织中转录水平的差异，可能与不同部位脑组织对缺氧缺血的不同易损性有关系。(3)、Par一4基因在新生大鼠缺氧缺血性脑病中的促凋亡之机制，可能与Ca 5 pa se一3的激活有关。第二部分Par一4反义寡核普酸拮杭谷氛酸诱导的PC12细胞凋亡 及其分子信号机制目的: 研究P盯一4反义寡核普酬吉抗谷氨酸诱导的PC 12细胞凋亡及其 分子信号机制。方法: (1)PC12细胞培养。设立正常对照组、谷氛酸诱导凋亡组、Par一4反义寡核普酸干预组、Par一4正义寡核普酸对照组、P ar一4错义寡核普酸对照组。 (2)以不同浓度谷氨酸诱导PC12细胞凋亡。 (3)利用脂质体将Par一4反义寡核普酸、Par一4正义寡核普酸、Par一4错义寡核普酸转染PC12细胞后，再予相同剂量的谷氛酸刺激PC12细胞凋亡。 (4)牙!」用叮吮橙/澳化乙锭、流式细胞分析和Hoeches t 33258/碘化丙锭检测细胞凋亡，并评价Par一4反义寡核普酸的抗凋亡作用。 (5)免疫细胞化学结合碘化丙锭染色，在激光共聚焦显微镜下双荧光观察Par一4在PC12细胞中的定位。 (6)We 5 t e rn blot测定各组Par一4和蛋白激酶Aktl(Thr308磷酸化)的蛋白表达量。 (7)比色法测定各组Caspase一3活性。 (8)凝胶电泳迁移率改变试验(EMSA)检测各组STAT3的DNA南京医科大学硕士学位论文结合力。 (9)RT一PCR测定各组凋亡蛋白抑制子(XIAP)和钙依赖性蛋白酶(Ca 1 pa 1 n 10)的mRNA水平。 (10)利用Fu ra/AM和激光共聚焦显微镜测定各组细胞内钙离子浓度。结果: (1)、“’r咤橙/澳化乙锭、流式细胞分析和Hoechest 33258/碘化丙锭荧光染色都显示了谷氛酸成功诱导PC 12细胞凋亡。 (2)、激光共聚焦显微镜双荧光显示Par一4主要定位在细胞核。 (3)、10林 mol/L Par一4反义寡核普酸可显著抑制10fnM谷氨酸 诱导的PC12细胞凋亡。 (4)、谷氨酸诱导凋亡组的磷酸化Aktl蛋白水平、XIAP的mRNA水平、STAT3的DNA结合力、Cyc 1 inDI蛋白的荧光强度显著低于正常对照组(P<0.肠)。Par一4反义寡核普酸干预组中磷酸化Akt，蛋白水平、XIAP的mRNA水平、STAT3的DNA结合力、CyclinDI蛋白的荧光强度显著高于谷氨酸诱导凋亡组(P<。.05或P<o.01)。而Par一4正义及错义寡核普酸对照组与谷氨酸诱导凋亡组相比，P> 0.05，无显著性差异。 (5)、谷氨酸诱导凋亡组Par一4蛋白、CasPase一3活性、细胞内钙离子浓度、Ca 1 Pa in10的mRNA水平显著高于正常对照组(P<0.05或P<0.02)。Par一4反义寡核普酸千预组中Par一4蛋白、Caspase一3活性、细胞内钙离子浓度、CalPain10的mRNA水平显著低于谷氨酸诱导凋亡组(P<0 . 05)。而Par一4正义及错义寡核普酸对照组与谷氨酸诱导凋亡组相比，P>0.05，无显著性差异。结论: (1)、Par一4反义寡核普酸能拮抗谷氨酸诱导的PC12细胞凋亡。 (2)、P ar一4反义寡核普酸抑制谷氨酸对PC 12细胞中Ak tl磷酸才七的 下调作用。 (3)、P ar一4反义寡核普酸抑制谷氨酸对PC12细胞中STAT3活性的 下调作用。南京医科大学硕士学位论文(4)、Par一4反义寡核普酸能抑制谷氨酸诱导的PC12细胞内钙离子浓度上调和钙依赖性蛋白酶Ca lpain10的基因转录上调。(5)、首次发现Par一反义寡核普酸的抗凋亡作用可能涉及到P工3K/Aktl和JAK/STAT3等多个信号通路的活化。