白内障是当今世界首要致盲眼病，其确切发病机制仍不明确。大量体内、体外实验证实活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)引起的氧化损伤参与了年龄相关性白内障形成和发展，是引起白内障的共同途径。而晶体上皮细胞凋亡是非先天性白内障共有的细胞学基础。后发性白内障作为白内障术后主要远期并发症之一，会使视力下降，甚至再次致盲，目前治疗多需行激光囊膜切开术，不仅增加患者经济负担，还存在视网膜脱离，黄斑囊样水肿等并发症，因此寻找安全有效的手段防治后发性白内障成为近年眼科研究的热点之一。研究显示后发性白内障源于白内障术后晶体上皮细胞增殖与死亡间动态平衡被打破，细胞过度增殖。近年提出通过诱导晶体上皮细胞凋亡，从而抑制细胞过渡增殖防治后发性白内障的方法。 有文献认为氧化损伤通过对细胞信号转导通路的调控参与转录因子激活，基因表达，细胞增殖分化和凋亡等众多生物学反应，tu对其作用机制所知有限。在众多信号通路中，对氧化应激敏感的转录因子核因子-к B(nuclear factor kappaB，NF-кB)因为在细胞免疫，炎症，分化和存活等牛物活动中发挥重要的作用，成为氧化损伤与信号通路研究领域的热点。在众多细胞系中已证实，H<,2>O<,2>介导的急性氧化损伤能通过泛素-蛋白酶体通路降解胞浆内抑制蛋白I-кB，从而激活NF-кB信号通路，进而调节一系列基因表达，参与白内障的形成，但是对其分子机制的研究不多。细胞内多条信号通路参与调节细胞生存和凋亡，研究较多除NF-kB信号通路，还包括转录激活蛋白-1 (activating protein-1，AP-1)，促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases)MAPKs中的磷酸化c-jun氨基末端激酶(JNK)，P38以及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt等信号通路，他们中有些是促进细胞发生凋亡的，有些是促进细胞生存而抑制凋亡的。既然细胞凋亡是白内障的细胞学基础，同时又是治疗后发性白内障的靶点，因此通过对氧化损伤调节与细胞凋亡和生存有关的信号转导通路的分子机制研究，将有助于对白内障形成机制的进一步了解，同时为防治后发性白内障提供理论依据。 随着对泛素-蛋白酶体通路(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)的深入研究发现，该通路介导的细胞蛋白降解是细胞调控的重要机制，尤其是通过降解细胞各通路的抑制因子或/和激活因子发挥关键的调控作用。之前的研究已证实在晶体上皮细胞中存在活跃的泛素-蛋白酶体通路，多数研究证实UPP参与了氧化损伤对NF-kB信号通路的调节。 本研究拟应用体外培养的人晶体上皮细胞SRA 01/04细胞系，用葡萄糖氧化酶持续产生H<,2>O<,2>作用于细胞建立慢性氧化损伤模型，凝胶滞留法检测核蛋白中NF-кB活性，观察慢性氧化损伤对晶体上皮细胞中NF-к B信号通路活性的影响。并用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞阻断UPP，蛋白免疫印迹检测胞浆中I-кB含量，旨在证实UPP参与了氧化损伤对NF-кB信号通路的调节，探寻氧化损伤调节信号转导通路的分子机制。同时还通过对晶体上皮细胞核蛋白内AP-1活性以及全细胞裂解产物中JNK，Akt，P38的含量变化的观察，旨在了解慢性氧化损伤对晶体上皮细胞内与细胞凋亡和存活有关的其他信号转导通路的调控作用及其分子机制。研究共分四部分，简述如下： 第一部分 H<,2>O<,2>介导慢性氧化损伤对人晶体上皮细胞中转录因子NF-кB活性及对胞浆内I-кB蛋白含量的影响。 目的：检测葡萄糖氧化酶持续产生H<,2>O<,2>介导的慢性氧化刺激对人晶体上皮细胞中转录因子NF-к B活性以及胞浆内NF-кB活性抑制蛋白Iк B含量的影响。 方法：按对照组及实验组(每组6个平行样)，实验组加入葡萄糖氧化酶，终浓度为40mU/ml，37℃的细胞培养箱内孵育4小时后，将对照组分为无药对照组，无药对照+TNF-α 15min组，无药对照+TNF-α 30min组，葡萄糖氧化酶处理组，葡萄糖氧化酶+TNF-α 15min组，葡萄糖氧化酶+TNF-α 30min组，每组2个平行样，分别加入TNF-α，终浓度为10ng/ml，达作用时间点后，提取核蛋白及胞浆蛋白，凝胶滞留法检测核蛋白中NF-кB活性，蛋白免疫印迹检测胞浆蛋白中I-кB含量。 结果：在人晶体上皮细胞SRA01/04细胞系中，TNF-α处理能诱导NF-кB与DNA结合的活性及胞浆蛋白中NF-к B抑制蛋白I-к B的降解，呈时间依赖性作用增强。而葡萄糖氧化酶处理则完全抑制TNF-α诱导的NF-кB活性，并减少TNF-α诱导的I-кB蛋白的降解。 结论：证实在人晶体上皮细胞SRA01/04细胞系中存在可被诱导的I-кB降解和NF-к B转录因子激活系统。在本研究应用葡萄糖氧化酶建立的体外慢性氧化损伤模型中，H<,2>O<,2>介导的氧化损伤会减少TNF-α诱导的I-кB蛋白的降解，进而抑制NF-кB信号通路的激活。 第二部分 H<,2>O<,2>介导慢性氧化损伤对人晶体上皮细胞中蛋白酶体活性的影响。 目的：检测H<,2>O<,2>介导慢性氧化损伤对人晶体上皮细胞内蛋白酶体活性的影响，探讨其抑制NF-кB活性的分子机制。 方法：设置对照组及实验组，实验组加入葡萄糖氧化酶，终浓度为40mU/ml，37℃的细胞培养箱内孵育4小时应用蛋白酶体活性检测探针检测蛋白酶体活性。 结果：蛋白酶体活性测定发现应用葡萄糖氧化酶建立的体外慢性氧化损伤模型中，人晶体上皮细胞内蛋白酶体的三种丰要的蛋白酶(糜蛋白酶、胰蛋白酶及PGPH酶)活性下降。 结论：慢性氧化损伤造成人晶体上皮细胞内蛋白酶体活性下降。 第三部分蛋白酶体抑制剂MGl32对人晶体上皮细胞中转录因子NF-кB活性及对胞浆内I-кB蛋白含量的影响。 目的：检测蛋白酶体抑制剂MG132处理对人晶体上皮细胞中转录因子NF-кB活性以及胞浆内NF-кB活性抑制蛋白I-к B含量的影响。 方法：设置无药对照组(2个平行样)，TNF-α组及MGl32组(各4个平行样)，MG132 组加入终浓度为10 μM的MG132，37℃的细胞培养箱内孵育4小时后，弃去旧培养液，TNF 组及MG132组加入含10％新生牛血清的DMEM培养液，按TNF-α15min组，TNF-α 30min组，MG132+1FNF-α 15min组，MG132+TNF-α 30min组，分别加入TNFα，终浓度为10ng/ml，各组2个平行样。到达作用时间点后，提取核蛋白及胞浆蛋白，凝胶滞留法检测核蛋白中NF-кB活性，免疫蛋白印迹检测胞浆蛋白中I-кB含量。 结果：MG132处理对抗TNF-α诱导的I-кB蛋白的降解，并减弱TNF-α诱导的NF-kB活性。抑制晶体上皮细胞内泛素-蛋白酶体通路能抑制I-кB降解，从而降低NF-кB活性，与氧化损伤造成的对NF-к B通路的效应相似。 结论：UPP部分参与了氧化损伤诱导NF-к B活性调节的过程中。 第四部分慢性氧化损伤和蛋白酶体抑制剂MG132处理对晶体上皮细胞中其他信号转导通路的影响。 目的：探讨氧化应激及UPP阻滞对AP-1，JNK，MAPK和Akt等信号通路活性的影响。 方法：凝胶滞留法检测H<,2>O<,2>及蛋白酶体抑制剂MG132处理的SRA 01/04细胞核蛋白中AP-1活性，蛋白免疫印迹法检测H<,2>O<,2>及蛋白酶体抑制剂MGl32处理的SRA 01/04细胞全细胞裂解产物中JNK，Akt，P38及其磷酸化蛋白的含量变化。 结果：慢性氧化损伤能协同TNF-α对AP-1活性的抑制作用。抑制蛋白酶体活性则显示增强TNF-α诱导的AP-1活性，15min时最为明显，之后作用逐渐减弱。慢性氧化损伤和抑制蛋白酶体活性均能使人晶体上皮细胞内Akt，P38信号通路中磷酸化蛋白含量增加，Akt，P38信号通路活性增强。而在JNK通路中，慢性氧化损伤使晶体上皮细胞内磷酸化JNK含量增加，而抑制蛋白酶体活性1小时后，细胞内磷酸化JNK含量下降，在3小时显示上皮细胞内磷酸化JNK含量增加。 结论：UPP参与了氧化损伤诱导的P38及PI3K/Akt信号转导通路等信号转导通路的调节过程。而在AP-1及JNK信号转导通路中，慢性氧化损伤通过独立于UPP的途径进行调节。