论文部分内容阅读
第一部分:血清外泌体源miR-21-5p在川崎病急性期亚急性期的表达目的:通过前期实验,我们筛选出了4种在川崎病急性期患儿与健康儿童之间差异表达的血清外泌体源miRNAs。在此基础上,我们将进一步研究川崎病血清外泌体中miRNAs在川崎病不同时期的表达,并探讨其是否与川崎病炎性损伤有关。方法收集2021年03月至2021年11月之间,在苏州大学附属儿童医院心血管内科住院治疗的川崎病患儿急性期(1-11天)及亚急性期(11-21天)清晨空腹静脉血12例,其中冠状动脉损伤组6例,非冠状动脉损伤组6例;并收集同期普通发热住院儿童及健康体检儿童清晨空腹血各12例,分别作为发热对照组和健康对照组。分离血清,通过超速离心法提取血清中外泌体,采用实时定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测目标miRNAs在各组间的相对表达量。采用SPSS软件对结果进行统计学分析,得出显著差异表达的目标miRNAs,并分析其在川崎病不同时期的差异表达。使用miRwalk、miRDB、TargetScan三个数据库系统对目标miRNAs进行靶基因预测,使用DAVID生物信息学分析软件对所获得的共同靶基因进行GO富集分析和KEGG通路解析,寻找与川崎病炎性损害相关的可能靶基因。结果:1.使用超速离心法可顺利分离出川崎病组、发热对照组和健康对照组儿童血清中的外泌体;2.血清外泌体miR-21-5p的表达:在川崎病急性期较健康对照组明显升高(p<0.05),但与发热对照组无显著差异(p>0.05);在川崎病亚急性期组较川崎病急性期、发热对照组和健康对照组明显升高,差异具有统计学意义(p<0.05);在川崎病急性期和亚急性期,血清外泌体源miR-21-5p的表达量在冠脉扩张组与冠脉未扩张组间均无显著差异(p>0.05);3.对miR-21-5p进行靶基因预测分析,共获得44个共同的靶基因,利用DAVID生物信息学分析软件结合文献查阅发现与炎症通路相关的靶基因主要为DDAH1、Stat3。4.血清外泌体miR-122a-5p与miR-150-5p、miR-125a-5p的表达量:在川崎病急性期、亚急性期组、发热对照组和健康对照组相比较,组间均无显著差异(p>0.05)。结论:1.血清外泌体源miR-21-5p水平在川崎病急性期明显高于健康对照组,但与发热对照组无显著差异,在亚急性期显著高于急性期及对照组;但在冠脉扩张组与冠脉未扩张组无显著差异。2.血清外泌体源的miR-21-5p可能参与川崎病炎性损害。第二部分:IL-6/Stat3介导的炎性通路在川崎病中的表达及临床意义目的:分析血清外泌体中miR-21-5p下游靶基因Stat3及其相关的IL-6/Stat3炎性通路有关的炎症因子在川崎病不同时期中的表达,并探讨其临床意义。方法收集2021年03月至2021年11月期间苏州大学附属儿童医院确诊川崎病并规范化治疗的川崎病患儿22例(急性期及亚急性期)清晨空腹血作为川崎组,其中冠状动脉损伤组10例,非冠状动脉损伤组12例;并收集同期住院普通发热儿童和健康儿童清晨空腹血作为对照组。分离血清后,采用硝酸还原酶法测定血清中NO水平,采用ELISA法测定血清IL-6、Stat3、TNF-a、eNOS浓度,SPSS软件对检测的蛋白、炎症因子浓度进行统计学分析。结果:1.川崎病急性期血清Stat3、IL-6水平较亚急性期、健康对照组和发热对照组水平显著增高(p<0.05),但在川崎病亚急性期血清Stat3、IL-6水平与发热对照组及健康对照组间无显著差异。2.川崎病急性血清eNOS、NO水平高于健康对照组(p<0.05),但与发热组表达无显著差异;在川崎病亚急性期血清中的eNOS、NO水平显著高于急性期、健康对照组和发热对照组(p<0.05);3.川崎病急性期血清中TNF-a水平较亚急性期、发热对照组和健康对照组水平显著上调(p<0.05),但在川崎病亚急性期血清TNF-a水平与发热对照组及健康对照组间无显著差异;4.在川崎病急性期时,血清TNF-a、Stat3在冠脉扩张组水平较冠脉非扩张组显著升高(p<0.05),而NO、eNOS在冠脉非扩张组水平较冠脉扩张组显著升高(p<0.05),IL-6在冠脉扩张组及非扩张组间无显著差异。(p>0.05)。5.在川崎病亚急性期,血清TNF-a、NO、eNOS、Stat3、IL-6在冠脉扩张组及非扩张组间无显著差异(p>0.05)。6.川崎病急性期Stat3与NO负相关,与TNF-a正相关;在亚急性期,Stat3与NO负相关,与TNF-a正相关。结论:1.在川崎病急性期IL-6/STA3通路激活,一定程度抑制NO表达,同时TNF-a水平增高,共同参与冠脉损害;2.在川崎病亚急性期,IL-6/Stat3通路被抑制,其对eNOS的抑制作用下降,NO产生增多,同时TNF-a表达下降,共同参与减轻川崎病炎性反应。