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研究目的1.建立大鼠急性肺损伤模型,观察清金化痰汤的抗炎作用,并为其临床应用提供实验数据参考;2.结合清金化痰汤抗炎及免疫调节的药理作用,建立合适的生物活性评价方法,以作为质量控制方法的补充;研究背景近年来,由于世界上大部分地区气候环境发生巨大改变,呼吸道疾病患者的发病率与死亡率逐年增加,是全球亟待解决的卫生健康问题。清金化痰汤选自明代医家叶文龄撰写的《医学统旨》这一古籍,是治疗肺系疾病的经典名方,此方收录于国家中医药管理局2018年发布的《古代经典名方目录(第一批)》中。通过查阅古籍发现,在古代中医临床上,清金化痰汤常用于治疗的肺系疾病主要系由痰热壅肺所致,现代临床则在AECOPD、CAP、急性支气管炎、慢性支气管炎等肺系疾病中广泛使用。由于清金化痰汤在治疗疾病方面具有抗炎、免疫调节、松弛气管平滑肌、降低耐药性等综合药理作用,关于其作用机制及临床应用方面的文献报道逐渐增多,然而关于清金化痰汤原方质量检测、药效物质基础的研究报道较少,而且由于原料药、制备工艺与古代的差异性,使药味众多及化学成分丰富的清金化痰汤在质量上的一致性难以得到保障,从而难以保障临床疗效的一致性。因此,研究和制订科学全面的质量标准是清金化痰汤研究开发中亟待解决的问题。近年来发展起来的生物活性测定方法因为具有专属性强、量效关系明确、简单快速、与临床功效相关联等诸多优点,已有不少关于其用于中药生物活性评价的报道,此方法应用于中药质量控制领域是未来的一种趋势。本研究结合清金化痰汤的功效及丰富的药理作用,通过建立急性肺损伤大鼠模型,探究清金化痰汤对该模型的药效学作用;结合清金化痰汤抗炎及免疫调节的药理作用,通过建立RAW264.7巨噬细胞炎症和吞噬模型,考察清金化痰汤对RAW264.7巨噬细胞对中性红吞噬指数和LPS诱导RAW264.7巨噬细胞分泌IL-6含量的影响,并寻找生物限值进行质量控制。研究内容1.清金化痰汤对急性肺损伤模型大鼠的抗炎作用研究雄性SD大鼠60只,按体重分层后,按照随机原则分成6个组,包括正常组、模型组、清金化痰汤低、中、高剂量组、地塞米松组,其中清金化痰汤各组的给药剂量分别为9.25、18.50、37.00g·kg-1·d-1,地塞米松组给药量为2mg·kg-1。先将大鼠进行适应性饲养,然后配制浓度为1%的戊巴比妥钠,以50mg·kg-1的剂量麻醉大鼠,气管滴注LPS200μg/只(200μg溶于生理盐水100μL)建立急性肺损伤模型大鼠,空白组以相同的方法气管滴注相同量的生理盐水,造模后48h开始给药,地塞米松组则一次性腹腔注射地塞米松磷酸钠注射液,清金化痰汤组连续进行灌胃给药7天,空白组和模型组同样灌胃相同剂量的生理盐水。7天后,1%戊巴比妥钠麻醉大鼠,采用HE染色的方法观察大鼠肺组织病理学改变;ELISA检测大鼠肺组织上清中炎症因子IL-1β、TNF-α含量;RT-qPCR检测各组大鼠血小板中MtDNA拷贝数的变化。2.基于巨噬细胞吞噬及分泌功能的清金化痰汤生物限值测定研究建立RAW264.7巨噬细胞吞噬和炎症模型,以清金化痰汤水提物冻干粉对RAW264.7巨噬细胞对中性红的吞噬指数和LPS诱导分泌IL-6含量的抑制率为指标,考察清金化痰汤水提物冻干粉的生物活性,并寻找生物限值用于质量控制。实验结果1.清金化痰汤对急性肺损伤模型大鼠的抗炎作用研究通过大鼠的肺组织病理学结果研究发现,空白组大鼠肺组织形态正常,肺泡腔清晰可见,细胞结构完整,未见到明显的炎性细胞浸润和肺间质水肿的现象;模型组大鼠肺组织则具有明显的的病理学损伤,可见肺泡结构被破坏,肺间隔明显增厚,气管管壁和肺泡腔内均有炎性细胞浸润和红细胞渗出的现象。与模型组病理学状态相比较,清金化痰汤各给药组以及地塞米松组大鼠病理学损伤程度可见明显减轻。ELISA实验检测结果表明模型组大鼠肺组织中TNF-α和IL-1β均升高,给予清金化痰汤治疗后,其低剂量、中、高剂量组及地塞米松组肺组织中IL-1β含量均得到显著降低。RT-qPCR实验结果显示,与空白组相比,模型组大鼠血小板中MtDNA拷贝数明显增多;与模型组相比,清金化痰汤中剂量组、高剂量组及地塞米松组MtDNA拷贝数明显降低。2.基于巨噬细胞吞噬及分泌功能的清金化痰汤生物限值测定研究实验结果表明巨噬细胞优选接种密度为3×105个/mL、药物作用时间为24h、LPS浓度为1μg·mL-1,当清金化痰汤水提物冻干粉终质量浓度为62.5~250μg·mL-1时,对巨噬细胞增殖有明显促进作用,当清金化痰汤水提物冻干粉质量浓度为500μg·mL-1时,对RAW264.7巨噬细胞既无毒性也无明显促增殖作用,且在此浓度下对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞IL-6分泌量呈现出显著的抑制作用,抑制率较为稳定,因此选择500 μg·mL-1作为限值剂量进行考察,并发现在此浓度下,巨噬细胞对性红吞噬指数不低于113%,对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞IL-6分泌量的抑制率不低于45%,且重复性良好。结论1.本研究证实,清金化痰汤给药后,对本实验建立的急性肺损伤模型大鼠有较为明显的治疗作用,可明显改善LPS导致的肺部炎症病理状态,降低肺组织中IL-1β分泌量和降低各组大鼠血小板中MtDNA拷贝数。2.本实验结合清金化痰汤抗炎及免疫调节的药理活性,建立了基于RAW264.7巨噬细胞吞噬及分泌功能的清金化痰汤水提物冻干粉生物限值评价方法,在本研究确定的实验条件下,确定500μg·mL-1为限值剂量,在该限值浓度下对巨噬细胞的吞噬指数有明显的促进作用或者对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞IL-6分泌量的有明显抑制作用(P<0.05),均可判断为质量合格。