胸膜肺炎放线杆菌(APP)是引起猪传染性胸膜肺炎的呼吸道病原细菌；猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)可引起一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为特征的烈性传染病。这两种病原均为当前公认的危害现代养猪业的重大传染性病原。本文在APP基因缺失突变致弱菌株构建成功的基础上，将PRRSV基因组中编码保护性抗原的ORF5基因片段插入APP基因缺失区，构建携带异源基因的APP细菌载体。本试验结果将为研制可同时预防APP和PRRSV这两种病原感染的细菌减毒活疫苗奠定坚实的基础。首先利用原核表达系统对PRRSV-ORF5基因片段进行表达分析以鉴定可在细菌中表达的抗原表位。利用PCR方法分别扩增ORF5基因缺失信号肽的D片段、缺失信号肽和跨膜区的L片段、缺失信号肽的5’端N片段和缺失跨膜区的3’端C片段，经克隆测序后分别插入原核表达载体pET-32a中进行表达，结果显示未缺失跨膜区的D片段未见表达产物，而L片段、N片段和C片段分别表达大小约为33 kDa、25 kDa和29 kDa的融合蛋白。Western blotting检测结果显示L片段表达蛋白可与PRRSV阳性血清发生结合反应，C片段反应性稍弱，而N片段未出现阳性反应。结果证实含有跨膜区的ORF5基因片段不能良好表达，C端在与GP5抗体结合方面具有重要作用。在ORF5基因不同功能区表达分析的基础上将ORF5基因片段(L)分别插入apxIA或apxIC基因缺失区以构建不同的突变菌株。利用双酶切分别自重组质粒pTAU、pT-ORF5L、pTChl~r和pTAD中切出1.8 kb的AU、348 bp的ORF5L、1.1 kb的Chl~r和1.7 kb的AD基因片段，将上述基因片段串联并插入pUC19的相应酶切位点，构建转移载体pUIA-L-Chl~r。用同样的方法分别自重组质粒pTCU、pT-ORF5L、pTChl~1和pTCL中切出2.2 kb的CU、348 bp的ORF5L、1.1 kb的Chl~r和1.8 kb的CL基因片段，将上述基因片段串联并插入pUC19的相应酶切位点，构建转移载体pUIC-L-Chl~r。将两种转移载体经电转化分别导入胸膜肺炎放线杆菌血清10型野生菌株中进行同源重组，筛选获得两种突变菌株。利用PCR和Southern Blotting对突变菌株进行了鉴定，并对突变菌株生物学特性进行了分析。结果表明，ORF5基因片段已成功导入突变菌株中，两种突变菌株均可正常增殖，连续传代后插入的Chl~r和ORF5基因片段可稳定遗传，与母源菌株相比毒力降低100倍以上，将突变菌株免疫小鼠后利用ELISA检测小鼠血清中GP5抗体水平，证实随免疫次数增加GP5抗体呈现逐步升高的趋势，提示突变菌株中携带的ORF5基因片段具有表达能力，同时ELISA检测结果显示apxIA基因缺失突变菌株的GP5抗体水平明显高于apxIC基因缺失突变菌株GP5抗体水平。