干酪被认为是我国乳品工业发展新的增长点。凝乳酶是干酪制作过程中的必需酶,其不仅可使牛乳凝结、并且影响干酪成熟过程中风味和质构的形成。随着世界干酪产量的攀升,用于干酪生产的皱胃酶越来越短缺,大量研究人员开始寻求凝乳酶的替代产品。利用野生微生物发酵生产凝乳酶虽然生产周期短、成本低,但是,微生物凝乳酶的蛋白水解活性较牛凝乳酶等动物性凝乳酶稍高,热稳定性也较高,从而导致生产的干酪易产生苦味。在我国,干酪用凝乳酶十分短缺,大量依赖进口,导致干酪生产成本较高。利用基因工程方法生产凝乳酶已成为新的研究热点,我国自主研发基因工程凝乳酶有着重要的意义。巴斯德毕赤酵母作为近年来高速发展的基因工程表达载体,具有安全性高、目的蛋白产量大、易规模化生产等优点,已用于表达多种蛋白质。本研究采用本实验室构建的重组毕赤酵母(含微小毛霉凝乳酶基因)表达微小毛霉凝乳酶。研究其发酵产酶的优化条件、酶纯化、酶学性质及其在干酪生产中的应用。主要结果如下:(1)重组毕赤酵母产凝乳酶发酵条件实验结果表明:重组毕赤酵母诱导24h后即进入稳定生长期,诱导216h时,总菌数和活菌数均达到最大值,然后进入衰亡期;重组毕赤酵母在192h时产凝乳酶活性达到最大值即300.0SU/mL,并且凝乳活性和蛋白水解活动的比值(C/P值)达到最大即27.91,而蛋白水解活性在诱导192h时相对较低,仅为12.00u/mL。电泳分析确定重组毕赤酵母产凝乳酶的分子量约为47kDa。(2)通过单因素实验确定了重组毕赤酵母在BMGY培养基中最佳生长条件:培养温度30℃、培养基pH值5.2、摇床转速280r/min、培养基摇瓶装液量5%(12.5mL/250mL)。(3)在产凝乳酶发酵条件的优化过程中,通过单因素实验和Plackett-Burman实验,筛选出3个对重组毕赤酵母产凝乳酶影响较大的重要因素:培养基摇瓶装液量(A)、甲醇添加量(B)和培养基起始pH值(C)。采用Box-Behnken响应面实验得出回归方程为:Y(凝乳酶活力)=472.20-42.81A-8.03B+24.43C+55.34AB- 16.99AC-47.57BC- 52.59A2-60.01 B2-131.34C2。在此基础上确定了三者的最佳值:培养基摇瓶装液量13.1%(32.65mL/250mL),甲醇添加量每24h,添加1.5%,培养基起始pH值为6.2。在此优化条件下,凝乳酶活力最大值为491.7SU/mL,与验证实验结果一致。(4)确定了基因工程凝乳酶的纯化方法:采用80%饱和度(0℃)硫酸铵沉淀,酶样品溶于0.1M磷酸盐缓冲液(pH5.8),经DEAE-52离子交换层析、葡聚糖G-75凝胶层析,酶纯度提高89.3倍,回收率为53.77%。电泳分析结果表明,纯化酶为单一蛋白条带。(5)酶学性质研究结果表明:基因工程凝乳酶最适温度为55℃,最适pH值为5.4。酶在酸性pH条件下活性较高,在碱性pH条件下酶活下降,在pH6.0时酶较稳定。(6)凝乳实验结果表明:随着凝乳酶添加量的增加,凝乳时间缩短;随着脱脂乳浓度的增加凝乳时间逐渐变长,脱脂乳中添加0.05M CaCl2可促进凝乳的形成。对原料乳凝乳粘度和质构的分析结果表明,基因工程凝乳酶和商品凝乳酶具有相似的凝乳特性。(7)利用商品凝乳酶和基因工程凝乳酶分别制作Cheddar干酪,比较其成熟后的感官、理化和微生物指标。结果表明,两种干酪的各项指标接近。虽然使用基因工程凝乳酶制作的干酪在成熟过程中蛋白水解程度略高于使用商品酶制作的干酪,但是,前者没有产生明显的苦味。本研究获得的基因工程凝乳酶可以应用于干酪生产中。