应激是指当机体受到各种内外环境因素刺激时,所表现出的非特异性、全身性反应,是以下丘脑-垂体-肾上腺皮质(hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA)轴激活为主的神经内分泌反应。适宜的应激反应有助于提高机体对环境的适应能力,而过度的应激则会引起HPA轴的持续激活,从而诱导分泌过量的糖皮质激素(glucocorticoid,GC)。应激反应诱导机体产生疾病的主要原因之一正是体内过高水平的糖皮质激素水平。异常分泌的GC与糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)结合,导致机体免疫功能下降,谷氨酸释放增加,产生兴奋性毒性;GC也能够直接导致海马神经元萎缩,突触结构和功能受损,影响突触可塑性。创新中药六味地黄苷糖(LW-AFC)是由中医“滋补肾阴”的经典代表名方——六味地黄方分离得到的、由活性成分群组成的组分中药,包含多糖(LWB-B)、糖苷(LWD-b)和寡糖(CA-30)三个活性成分群,已通过国家食品药品监督管理总局批准正在进行II期临床试验。本实验室前期已对LWAFC的药理作用和机制进行了比较系统的研究,研究结果表明LW-AFC对阿尔茨海默症(AD)样认知功能障碍、老化样认知功能障碍、多种急性应激和皮质酮(CORT)所致的学习记忆损伤具有明显的改善作用,其作用与其调节机体神经内分泌免疫网络平衡密切相关。目前,LW-AFC的三个活性成分群及其主要活性成分对中枢神经系统突触可塑性的作用和机制尚不十分清楚。因此,本课题拟采用急性外源性皮质酮皮下注射模型,以长时程增强(LTP)为突触可塑性的代表性指标,观察LW-AFC及其活性成分对突触可塑性的作用及机制。第一部分LW-AFC及其活性成分对皮质酮致LTP损伤的保护作用研究1.LW-AFC对皮质酮致LTP损伤的保护作用研究皮下注射皮质酮(CORT,50mg/kg)能够显著抑制高频刺激后群峰电位的增强,表明CORT导致了LTP损伤。连续灌胃LW-AFC 7天对CORT致LTP损伤具有明显的保护作用,且在0.8-3.2g/kg的剂量范围内具有剂量依赖性,而0.4g/kg的LW-AFC对LTP损伤明显无保护作用。2.活性成分群对皮质酮致LTP损伤的作用研究进而观察了LW-AFC的三个活性成分群LWB-B、LWD-b和CA-30对皮质酮导致LTP损伤的影响,结果表明,与0.8g/kg LW-AFC剂量对应的三个活性成分群(LWB-B 0.16g/kg、LWD-b 0.12g/kg和CA-30 0.52g/kg)中,仅CA-30对CORT所致LTP损伤具有明显保护作用,而LWB-B和LWD-b无明显作用;当LW-AFC剂量增加至1.6g/kg时,与之对应的三个活性成分群(LWB-B0.32g/kg、LWD-b 0.24g/kg和CA-30 1.04g/kg)均对CORT所致LTP损伤具有明显保护作用。依据上述结果,结合前期LW-AFC对APP/PS1转基因模型小鼠和SAMP8模型小鼠学习记忆功能的最佳剂量,选取1.6 g/kg剂量的LW-AFC。3.主要活性成分对皮质酮致LTP损伤的作用研究进一步选择了LWD-b中的马钱苷(LOG)、莫诺苷(MOR)和芍药苷(PF)、CA-30中的水苏糖(STA),观察了其对皮质酮致LTP损伤的影响。结果发现,连续灌胃LOG(50mg/kg)、MOR(50mg/kg)、PF(50mg/kg)和STA(450 mg/kg)7天均对CORT所致LTP损伤具有明显保护作用。本部分实验观察了LW-AFC、三个活性成分群和主要的活性成分对CORT致LTP损伤的保护作用,结果表明其均对CORT致LTP损伤具有显著的保护作用。第二部分LW-AFC活性成分对皮质酮致LTP损伤的作用途径研究第一部分研究已经证明,LW-AFC、三个活性成分群以及主要的活性成分均对CORT致LTP损伤具有明显的保护作用。然而,其保护作用是直接作用于中枢神经系统,还是间接影响中枢神经系统尚不明确。因此,本部分研究采用不同给药周期和给药途径的方式观察LW-AFC活性成分的作用异同。1.不同给药周期和途径对LW-AFC活性成分作用的影响首先,采用单次侧脑室注射、灌胃和腹腔注射等给药方式观察了LW-AFC主要活性成分(LOG、MOR、PF和STA)对CORT所致LTP损伤的影响。结果表明,单次给予LW-AFC活性成分均对LTP损伤无保护作用。其次,采用多次灌胃和腹腔注射等给药方式观察了LW-AFC主要活性成分对CORT所致LTP损伤的影响。结果表明,多次给予LW-AFC活性成分对LTP损伤具有显著的保护作用。该结果提示,LW-AFC主要活性成分可能并非通过直接途径影响中枢神经系统功能,而是通过间接途径发挥作用。2.肠道菌群和免疫功能对LW-AFC活性成分作用的影响首先,在多次给予STA实验中,灌胃STA对CORT所致的LTP具有明显的保护作用,而腹腔注射STA无明显作用,提示STA可能作用于肠道菌群而间接对LTP损伤发挥保护作用。其次,采用组合抗生素抑制了机体的肠道菌群,同时观察LW-AFC及其主要活性成分对CORT致LTP损伤的保护作用。结果表明,组合抗生素抑制了CA-30及STA对LTP损伤的保护作用,而对LWB-B、LWD-b及其活性成分的作用无明显影响,进一步提示CA-30和STA可能作用于肠道菌群而间接对LTP损伤发挥保护作用,且LW-AFC中三个活性成分群的作用途径并不完全一致。最后,采用环磷酰胺抑制了机体的免疫功能,同时观察LW-AFC及其主要活性成分对CORT致LTP损伤的保护作用。结果表明,环磷酰胺抑制了LWAFC对LTP损伤的保护作用,提示LW-AFC可能通过调节机体免疫功能而间接对LTP损伤发挥作用。综上所述,该部分研究采用不同给药周期和途径的方式,观察LW-AFC中主要的活性成分对CORT致LTP损伤的保护作用。结果提示,LW-AFC主要活性成分可能通过外周间接途径对LTP损伤发挥保护作用。组合抗生素抑制了CA-30和STA的作用,提示CA-30和STA可能通过作用于肠道菌群发挥对LTP损伤的保护作用。免疫抑制剂抑制了LW-AFC的作用,提示LW-AFC可能通过调节机体免疫功能发挥对LTP损伤的保护作用。第三部分LW-AFC及其活性成分对皮质酮致LTP损伤的作用机制研究1.LW-AFC及其活性成分对肠道菌群和肠道免疫功能的影响结果表明,在门水平上,正常组小鼠肠道菌群主要以拟杆菌门、厚壁菌门和蓝藻菌门为主,而CORT模型组小鼠肠道菌群主要以拟杆菌门、厚壁菌门和脱铁杆菌门为主。CORT模型组与正常组比较,其中拟杆菌门水平降低,蓝藻菌门水平降低至小于1%,而脱铁杆菌门水平明显升高,提示皮下注射皮质酮诱导了肠道菌群结构变化。PCA聚类分析结果表明正常组与CORT模型组小鼠之间的肠道菌群存在明显差异,LW-AFC、CA-30和STA在一定程度上恢复了CORT所致的肠道菌群变化,而LWB-B、LWD-b及其活性成分对肠道菌群变化无影响。CORT导致小鼠结肠分泌型免疫球蛋白(SIg A)水平呈下降趋势,但无显著性差异。2.LW-AFC及其活性成分对中枢氨基酸类神经递质的影响结果显示,CORT显著诱导了谷氨酸(Glu)和γ-氨基丁酸(GABA)水平的升高,而对D-丝氨酸(D-ser)水平无显著影响。LW-AFC、CA-30和STA能够显著降低Glu水平,LWB-B、LWD-b和LOG具有降低Glu水平的趋势,但无显著性差异。LW-AFC及其活性成分同样具有低GABA水平的趋势。LW-AFC能够显著促进D-ser水平的升高。3.LW-AFC及其活性成分对D-ser代谢通路的影响结果显示,CORT显著诱导了海马组织中葡萄糖水平、3-磷酸甘油酸脱氢酶(PHGDH)、Na+依赖的丙氨酸-丝氨酸-半胱氨酸转运体-1(Asc-1)和囊泡相关蛋白2(VAMP2)蛋白表达水平的降低,以及丝氨酸消旋酶(SR)蛋白表达水平的升高。LW-AFC及其活性成分能够促进葡萄糖水平、PHGDH、Asc-1和VAMP2蛋白表达水平的升高,以及SR蛋白表达水平的降低。综上所述,在外周系统,CORT诱导了肠道菌群的变化;在中枢神经系统,CORT诱导Glu和GABA的大量积累,以及影响了NMDA受体辅助激动D-ser的合成、转运和分泌,导致NMDA受体功能降低,进而损伤突触可塑性。LWAFC、CA-30和STA能够一定程度上恢复CORT导致的肠道菌群改变,具有调节肠道菌群的作用;LW-AFC及其部分活性成分能够降低Glu水平、升高D-ser水平,调节D-ser的合成、转运和分泌,促进了NMDA受体功能,从而对CORT所致的LTP损伤发挥保护作用。通过以上三部分研究,本论文研究主要得出以下结论:1.单次给药LW-AFC及其活性成分对皮质酮致LTP损伤没有明显作用,多次给药可明显发挥对皮质酮所致LTP损伤的保护作用,免疫抑制剂可阻断其对LTP损伤的保护作用,提示LW-AFC及其活性成分是通过调节免疫功能间接发挥作用。2.抗生素抑制肠道菌后可明显抑制CA-30对LTP的保护作用,但对其他活性成分无明显影响,提示LW-AFC及其活性成分是通过肠道菌等不同途径发挥调节作用。3.调节中枢D-丝氨酸代谢、转运等通路的关键环节,进而降低NMDA受体功能是皮质酮致LTP损伤的重要因素之一;LW-AFC及其活性成分可通过对D-丝氨酸代谢、转运等通路的调节发挥其对皮质酮致LTP损伤的保护作用。本研究对于明确LW-AFC的物质基础、配伍研究及作用机制提供了实验依据,为进一步深入研究奠定了基础,也为中药复方研究提供了借鉴;首次阐明了D-丝氨酸合成、转运和分泌等通路是皮质酮致LTP损伤重要机制,为防治应激等所致认知功能损伤提供了潜在的干预靶点和策略,具有重要的科学意义和潜在的应用价值。