研究目的:组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACI）是一类在染色质水平调控基因表达的化合物,其所调控的基因与细胞周期停滞,细胞分化及细胞凋亡等重要生物学效应密切相关。HDACI对众多实体器官和血液系统肿瘤中具有强大的抗肿瘤活性,因此围绕HDACI的研究主要集中于肿瘤领域。新近研究发现,HDACI具备改善自身免疫性疾病模型症状,调控固有免疫功能以及抑制促炎细胞因子表达等一系列免疫调节活性。T淋巴细胞作为免疫反应的中心环节,在炎症免疫性疾病和移植免疫中发挥重要作用。然而HDACI对T淋巴细胞功能的调控作用和机制及其对移植排斥反应的影响少有报道,其分子机制有待于进一步阐明。我们通过设计体外和体内实验,研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA对T淋巴细胞增殖、活化和分化功能,基因表达调控和移植排斥反应的影响,以探讨HDACI在体外和体内对T淋巴细胞的调控作用及分子机制。研究方法:（1）MACS法体外分选小鼠脾脏来源CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞,通过ConA或培养板包被的抗CD3/CD28活化,并加入不同浓度SAHA干预,3H-TdR法检测细胞增殖,FCM检测T细胞活化标志分子及细胞凋亡情况,荧光定量PCR检测促炎细胞因子表达,Western-blot分析NF-κB、NFAT等转录因子表达的变化。（2）CD4⁺T细胞体外分选及活化同前,流式及荧光定量PCR检测Foxp3表达,分析SAHA对Treg分化的影响;MACS法分选Treg和Teff细胞,分别活化并给予SAHA干预,荧光定量PCR检测FOXP3表达,分析SAHA对Treg体外扩增,Teff转化的作用;CFSE标记的Teff与Treg按照不同比例混合并活化,流式检测增殖情况以分析SAHA对Treg抑制功能的影响,并探讨其分子机制。（3）体外诱导CD4⁺T细胞向Th17分化,并加入不同浓度SAHA干预,流式检测IL-17A蛋白表达,荧光定量PCR检测Th17相关基因表达变化,分析SAHA调控Th17分化的分子机制。（4）构建小鼠颈部异位心脏移植模型（BALB/C→C57）,观察单独应用SAHA及联合雷帕霉素（RPM）对移植物存活期的影响,取心脏移植物进行病理分析,荧光定量检测移植物内炎性因子表达;移植后第7天流式检测胸腺、脾脏、淋巴结中Treg的比例;过继转移研究SAHA在体内对Teff的转化作用;流式检测SAHA对Treg抑制功能的影响;探讨SAHA对移植排斥反应的调控作用与分子机制。（5）检测SAHA处理组和DMSO处理组小鼠脾脏来源Treg细胞活化前后HDACs表达情况,筛选调控Treg细胞分化的关键HDACs,构建相应siRNA转染Jurkat细胞,荧光定量PCR检测Treg相关基因表达,验证HDACs对Treg细胞分化的调控作用。结果:（1）SAHA对T淋巴细胞增殖、活化和分化的影响: SAHA呈时间及剂量依赖性的抑制CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞增殖;高浓度SAHA显著抑制CD25和NF-κB表达,而CD69在活化后2h,6h和12h均无显著改变,提示SAHA影响T细胞中后期活化;SAHA阻断IL-2、IFN-γ、IL-12、TNF-α、和IL-10等促炎细胞因子表达;SAHA呈时间及剂量依赖性的促进T细胞凋亡。同时显著抑制体外诱导的Th17分化,提示高浓度SAHA可通过干预T淋巴细胞活化和众多促炎基因表达发挥免疫抑制作用。（2）SAHA在体外对Treg细胞的诱导作用:随着SAHA浓度的增加, CD4⁺Foxp3⁺T细胞所占的比例显著降低,高浓度SAHA显著下调Foxp3基因表达,而低浓度SAHA（0.1μM）轻度增加了Treg的比例,但没有上调FOXP3表达,流式检测显示低浓度SAHA选择性诱导Teff细胞凋亡,从而间接增加了Treg比例。尽管荧光定量PCR检测显示SAHA在体外不能促进Treg扩增或Teff向Treg转化,但SAHA可通过上调CTLA-4增强Treg的抑制功能。（3）SAHA对Th17分化的影响:流式检测显示SAHA（0.1-1μM）显著抑制IL-17A表达,低浓度SAHA显著抑制IL-17A、IL-17F和STAT3表达,而不影响RORγt,提示SAHA可能通过抑制STAT3通路抑制Th17分化。有趣的是,与对照组相比,SAHA处理后的Th17中FOXP3表达显著上调,显示SAHA可能参与调控Treg和Th17平衡。（4）在小鼠颈部异位心脏移植模型中,载体对照组移植物在7天内即发生排斥反应而停跳,而50mg/kg SAHA显著延长移植物中期存活时间（MST）至16天,而低于治疗剂量的RPM（0.1mg/kg）延长移植物MST至10天,当50mg/kg SAHA与低剂量RPM联合应用时,显著延长移植物MST至26天;组织病理检测显示对照组伴随着心肌结构破坏和间质细胞浸润,SAHA处理组移植物心肌结构仍完整,但间质细胞浸润部分得到改善,而联合用药组既保持了心肌结构完整又阻止了间质细胞浸润。移植物检测发现SAHA处理组Foxp3、CTLA-4、IL-10基因表达显著上调,CD11b、IL-17、INF-γ表达下调,提示SAHA在体内促进Treg分化而抑制Th1和Th17分化。（5）SAHA处理组受者体内胸腺、淋巴结和脾脏中Foxp3⁺T细胞比例显著升高,其抑制功能与对照相比显著增强;过继转移实验发现SAHA在体内不能促进外周CD4⁺CD25^-T细胞转化为CD4⁺Foxp3⁺Treg,这些结果表明SAHA在体内增加胸腺来源的天然Treg数量,而非外周转化;在IL-^2-/-小鼠受者移植模型中,50mg/kg SAHA无法延长移植物存活时间,由于IL-2对Treg发育必不可少,这些结果提示Treg在SAHA介导的抗移植排斥作用中至关重要。（5）荧光定量PCR检测显示,HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC7在Treg活化后显著升高,但SAHA处理组与DMSO处理组之间无显著性差异,而HDAC9在活化后显著降低,SAHA处理组进一步下调HDAC9表达,二者之间具有显著性差异,体外通过小siRNA干扰HDAC9可显著上调Foxp3和CTLA4基因表达,提示HDAC9在Treg发育过程中发挥重要作用。结论:本文探讨了SAHA对T淋巴细胞功能和移植排斥反应的调控作用及分子机制。SAHA被证实发挥多种T淋巴细胞调节功能。高浓度SAHA在体外显著促进T细胞凋亡,抑制T淋巴细胞增殖、活化和众多促炎基因表达。而低浓度SAHA显著增强Treg的抑制功能并可能参与调控Treg和Th17平衡;体内研究显示SAHA通过增加胸腺来源Treg的数量和增强Treg的抑制功能而抑制急性排斥反应的发生。而HDAC9可能对Treg分化和发挥抑制功能具有重要调控作用,这些结果提示SAHA在体内和体外通过不同的机制调控Treg分化,而进一步研究显示HDAC9在Treg分化过程中发挥关键作用。本文证实了SAHA的抗移植排斥作用,并对其机制进行浅析,为HDACI应用于器官移植提供了一定的依据。