研究背景骨质疏松（Osteoporosis,OP）是一种常见全身代谢性骨病,以骨量减少、骨微结构破坏、脆性增高、力学强度下降为特征,易增加骨折风险。随着人口老龄化进展,骨质疏松发病率正逐步升高,并已成为我国面临的重要公共健康问题。骨稳态的过程涉及成骨细胞介导的新骨形成与破骨细胞介导的旧骨吸收之间的动态平衡,并受到机体多个器官、系统的复杂调控。当调控异常时,骨代谢平衡被打破,骨形成小于骨吸收,即可表现为骨量减少、结构破坏,最终导致骨质疏松。至于哪些因素影响了骨代谢的平衡,及这些因素在骨质疏松病理机制中的具体作用,尚未完全阐明。因此,进一步探索骨质疏松发病机制及新型有效治疗策略意义深远。肌肉组织与骨组织关系密切。肌肉减少/萎缩能引起骨量下降;而通过肌肉锻炼,也是改善骨质疏松的重要手段。既往研究认为,肌肉收缩对骨相关细胞产生力学刺激,是其调控骨代谢的主要方式。最新研究表明,肌肉的内分泌功能及分泌产物可与骨相关细胞实现通讯,对骨代谢的平衡发挥着重要调控作用。细胞外囊泡（Extracellular Vesicles,EVs）参与细胞间通讯是近年的研究热点。其中,以外泌体（Exosomes,Exos）为介质,完成生物学信号在不同组织、细胞间传递被报道广泛参与机体的生理、病理过程,并在疾病诊断、再生医学、慢性疾病治疗等领域具有广泛应用价值。基于团队前期研究基础,我们收集了OP患者和非OP受试者的血清标本,分离并鉴定外泌体后,通过基因芯片筛查,在OP患者血清外泌体检测到了肌肉特异性生物学信号表达升高。由此,我们提出科学问题:衰老过程中,肌代谢过程与骨稳态状态具有高度相关性;成骨细胞是骨代谢过程中主要功能细胞,肌肉可能通过分泌外泌体,传递生物学信号,调节成骨细胞功能来影响骨代谢过程。目的建立成肌细胞培养、肌源性外泌体提取纯化、细胞摄取外泌体相关实验的方法;探索成肌细胞源性外泌体对成骨细胞功能调控作用,及其对骨代谢能力的影响;探索抑制成肌细胞分泌外泌体后,对成骨细胞活性及骨代谢能力变化的影响;提取成肌细胞源性外泌体并进行蛋白组学检测,探索调控成骨细胞功能影响骨代谢能力的潜在靶点与作用机制。方法1.培养成肌细胞,光学显微镜观察细胞形态,免疫荧光染色鉴定细胞表面标志物;浓缩、提取、纯化细胞外泌体,透射电镜观察外泌体形态学,粒径分析仪检测外泌体颗粒大小;将上述外泌体与成骨细胞共培养,观察其被吞噬、摄取情况。2.对成肌细胞进行体外乳酸干预,模拟体外衰老环境;提取上述细胞分泌的外泌体并与成骨细胞共培养,探究肌源性外泌体对成骨细胞增殖、迁移、分化等活性的影响;将外泌体注射进小鼠体内,利用Micro-CT分析骨量变化,探索肌源性外泌体对骨生成能力的影响。3.构建Transwell细胞共培养体系,利用GW4869/Rab27a si RNA抑制成肌细胞分泌外泌体,探索其对成骨细胞分化能力的影响;构造小鼠去卵巢骨质疏松模型,注射外泌体抑制剂,观察是否能够缓解小鼠骨量丢失状况。4.培养成肌细胞与HEK293T细胞,提取上述细胞外泌体进行蛋白组学检测,并进行生物信息学分析,寻找肌源性外泌体中存在的差异蛋白,探索肌源性外泌体调控成骨细胞功能的潜在靶点与作用机制。结果1.成肌细胞贴壁生长呈梭形,并以纤维状形态向四周伸展;经诱导分化后,免疫荧光染色显示细胞呈MHC阳性。透射电镜观察见成肌细胞源性外泌体呈半球形,且呈现散在分布的双层囊膜状超微结构;粒径分析提示外泌体直径大小分布在30nm-150nm之间。细胞摄取实验见成肌细胞来源外泌体可被成骨细胞吞噬进入胞内,并与之整合。2.对成肌细胞进行体外乳酸干预后,测得成肌细胞内乳酸含量增高;将上述细胞分泌的外泌体分别与成骨细胞共孵育,发现能够抑制成骨细胞增殖、迁移和分化能力。动物实验表明,上述细胞来源的外泌体能够加速小鼠骨量丢失,抑制骨生成能力。3.Transwell细胞共培养实验发现,成肌细胞可通过外泌体途径作用于成骨细胞,而通过GW4869/Rab27a si RNA抑制肌源性外泌体分泌后,成骨细胞功能得到恢复。对去卵巢小鼠注射外泌体抑制剂后,小鼠骨丢失状态得到缓解。4.与HEK293T细胞来源外泌体相比,成肌细胞来源外泌体有477个蛋白高表达,有578个蛋白低表达。成肌细胞源性外泌体可以通过调控细胞衰老、m TOR以及GSH相关通路来影响成骨细胞活性,进而引起骨代谢变化。结论1.正确建立成肌细胞培养、肌源性外泌体提取纯化方法,经鉴定符合成肌细胞和外泌体的鉴定表征,且提取的外泌体可被成骨细胞摄取。2.成肌细胞体外添加乳酸干预后可模拟衰老过程中肌肉的变化状态;肌肉可通过分泌外泌体,作用于成骨细胞,抑制成骨细胞增殖、迁移和分化能力;动物实验发现,上述外泌体给药后可抑制小鼠骨生成能力。3.抑制成肌细胞分泌外泌体,可缓解其对成骨细胞的抑制效应,表现为成骨能力得到增强;动物实验发现,抑制成肌细胞分泌外泌体可缓解骨质疏松小鼠骨量丢失状态。4.与HEK293T细胞来源外泌体相比,成肌细胞来源外泌体蛋白表达谱具有显著差异,这些差异蛋白影响着细胞功能,并与多种信号通路具有相关性。成肌细胞源性外泌体可以通过调控细胞衰老、m TOR以及GSH相关通路来影响成骨细胞活性,进而引起骨代谢变化。