AMP激活的蛋白激酶(AMPK)作为一种重要的能量感受因子对有机体从恶劣环境中存活至关重要。AMPK是个由三个亚基组成的异源三聚体,其中α亚基是催化亚基,β和γ是调节亚基。AMPK家族成员广泛存在于真核生物中,包括植物,酵母,线虫,昆虫,以及哺乳动物。迄今为止,甲壳类动物AMPK激酶的存在还未被报道。卤虫是一种原始的甲壳类动物,它能够产下休眠胚胎来应对恶劣的环境胁迫。这种包囊胚胎可以以极低的代谢率保持休眠状态多年,只有在环境适宜的情况下才会继续发育。但是,卤虫休眠和休眠后发育的内在调节机制现在还未研究清楚。作为一种重要的压力感受因子和能量调节因子,AMPK很可能跟卤虫应对外界刺激和选择繁殖方式有关。为了探索AMPK在卤虫生活史中的功能,我们从卤虫中分离了两种AMPKα亚基的cDNA分子。同时,我们对卤虫AMPKα基因在卤虫生活史中,以及卤虫在应激反应中的表达特征进行了分析。此外,利用特异性针对于磷酸化AMPK的抗体,我们对AMPK激酶在卤虫滞育后发育过程中的功能也进行了的研究。主要研究结果可以分为以下两部分:1.采用简并引物PCR方法,我们从卤虫中分离得到了两种AMPKα亚基的cDNA序列,分别命名为Afr-AMFKalpha1和Afr-AMPKalpha2。Afr-AMPKalpha1分子全长1858 bp,其开放阅读框长度为1548 bp,编码了515个氨基酸残基(命名为Afr-AMPKALPHA1)。此氨基酸序列具有基本的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域。Afr-AMPKalpha2核酸序列与Afr-AMPKalpha1相比,在开放式阅读框长度少了244 bp,其他序列相同。因此,这个244 bp的缺失造成了移码突变,提早引入了一个终止密码子,使Afr-AMPKALPHA2蛋白的C末端变短。我们认为这两个cDNA可能来自于同一个基因的的选择性剪切。这两个蛋白质的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域与其他物种AMPK的激酶域具有＞64%的相似性。此外,我们还采用半定量RT-PCR分析方法来检测AMPKα基因的表达情况。实验结果表明,Afr-AMPKalpha1基2.因在卤虫发育过程中以及应激反应中均呈现差异性表达。成虫的Afr-AMPKalpha1基因在热胁迫条件下表达减少,但是这种减少并不具有时间和温度依赖性。与此相反,休眠卵中Afr-AMPKalpha1基因的表达随热激时间的延长而减少。在高渗胁迫下,成虫中Afr-AMPKalpha1的表达量先是减少,然后随着胁迫时间的延长而增加。在饥饿条件下,成体的Afr-AMPKalpba1表达量随饥饿时间的延长而减少,直到第九天不能被检测到。而且,我们的结果还证明,在将产休眠卵的卤虫头部,Afr-AMPKalphs1的表达量急剧减少,这暗示着AMPK可能与卤虫的生殖方式改变有关。此外,Afr-AMPKalpha2分子的表达量太低,只能用巢式PCR检测到。Southern blotting表明卤虫的AMPK基因在基因组中可能以多拷贝形式存在。3.利用一个特异性结合磷酸化AMPK的抗体,本研究证明AMPK激酶在卤虫滞育后发育过程中特异性磷酸化。利用胚胎整体免疫组化技术,我们发现磷酸化的AMPK在早期的滞育后发育胚胎中主要成环状分布在外胚层部位,并且,随着发育的进行AMPK的磷酸化圈不断改变。另外,通过Western印记的方法,我们检测到磷酸化的AMPK与细胞核结合,而且这种结合不受细胞内pH值改变的影响。胚胎细胞核的免疫荧光染色实验也证明了这点。这些结果说明卤虫的AMPK激酶可能在发育继续后的基因表达调控上有作用。而且,我们用高效液相色谱法测定了胚胎内AMP,ADP,ATP的含量,结果表明卤虫AMPK的磷酸化不随AMP∶ATP的比值而变化。总之,我们在卤虫中克隆和鉴定了AMPKα基因从而首次证明了AMPK在甲壳类生物中的存在。此外,我们的研究结果暗示了AMPK激酶在卤虫应激和发育过程中,尤其是在滞育后发育的过程中起重要作用。本研究结果为更深入的探索AMPK功能和卤虫的发育生物学研究提供了宝贵的信息。