臭氧对‘赤霞珠’的伤害及VvKEG的克隆与功能鉴定

来源 :山东农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:flyindirty2008
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近年来由于工业及交通运输业的快速发展,挥发性有机物和氮氧化合物等臭氧前体大量释放到大气中,导致近地面臭氧浓度加速上升。臭氧会对地面植物造成胁迫伤害,植物的光合作用会发生损伤、叶片失绿、产量损失。面对逆境胁迫时,植物会通过自身反应抵抗胁迫造成的伤害,泛素化系统参与免疫反应、生长发育、程序性细胞死亡过程,调节植物免疫信号过程。环型E3泛素连接酶已被证明在各种植物激素信号通路中发挥着重要的作用,脱落酸(ABA)信号参与介导许多非生物胁迫反应。本文以‘赤霞珠’为试验材料研究了臭氧对葡萄叶片光系统的响应;从葡萄叶片应对臭氧胁迫的蛋白质组学响应中筛选差异表达蛋白E3泛素连接酶VvKEG,通过E3泛素连接酶VvKEG的克隆与功能鉴定研究了 VvKEG对臭氧和ABA的响应。同时通过酵母双杂交初步筛选到了VvKEG的互作蛋白VvABI3。主要结果如下:(1)臭氧胁迫增加了‘赤霞珠’葡萄叶片超氧阴离子和过氧化氢含量,降低了 ABS/CSm,TRo/CSm、Eto/CSm,反应中心单位能量消耗DIo/RC显著增加,光系统相关参数Fv/Fm、Y(Ⅱ)、Pm、Y(Ⅰ)下降,Y(NPQ)上升,环式电子传递受阻,光系统相关基因及蛋白下调,抗氧化系统相关基因上调。说明臭氧会对植物光系统产生破坏作用,对叶片造成了光化学损伤。对臭氧处理后的‘赤霞珠’葡萄叶片进行蛋白质组学分析,找到了臭氧胁迫后表达显著上调的E3泛素连接酶KEG。(2)抗臭氧能力强的品种在臭氧胁迫后内源ABA含量较低,抗臭氧能力差的品种在臭氧胁迫后内源ABA含量高。50μmol·L-1外源ABA处理对‘赤霞珠’葡萄叶片没有显著影响,但在臭氧处理后,5 0μmol·L-1ABA较单独臭氧胁迫伤害程度小,而150μmolμL-1ABA复合臭氧处理造成了协同胁迫,破坏植物的光系统,使光系统相关荧光参数Y(Ⅱ)、Y(Ⅰ)、Fv/Fm、Y(ND)发生显著变化;降解葡萄叶片中的叶绿素,积累大量活性氧,提高MDA含量。(3)对VvKEG进行克隆与功能鉴定。亚细胞定位预测发现VvKEG定位于细胞核,对其顺式启动子作用元件分析,含有光模块响应元件、ABA响应元件、低温响应元件等。VvKEG在2.5h臭氧处理后表达量最高,在6hABA处理后表达量最高,不同器官在叶中的表达量最高;不同葡萄品种VvKEG表达量与品种抗臭氧能力具有较强相关性。KEG异源表达拟南芥对ABA不敏感,拟南芥种子出芽率高,根系长;转基因株系与野生型株系相比,臭氧胁迫下伤害较轻,叶片状态好于野生型,总叶绿素含量高,丙二醛含量低,光合荧光参数Fv/Fm、Y(Ⅰ)、Y(Ⅱ)、Y(NA)高,Y(NA)、Y(NPQ)低,光系统相关基因较野生型表达量高。(4)利用酵母双杂交方法初步验证VvKEG与VvABI3互作。VvABI3表达量响应臭氧胁迫,臭氧处理后VvABI3表达量下调,2.5h表达量最低,无臭氧条件下,‘赤霞珠’中最高,‘美乐’中表达量最低;臭氧处理后,VvABI3‘美乐’中表达量最高,‘天赐’中表达量最低。
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