小细胞外囊泡（small extracellular vesicles,sEVs）在疾病的诊断和治疗方面具有重要的价值。通过适当的程序直接从各种组织中分离纯化获得的sEVs,可以反映机体的生理和病理状态。然而,在分离过程中,s EV的质量受到许多因素的影响,包括组织和细胞碎片的污染,组织消化酶的种类,以及组织的储存状态。在本研究中,我们通过比较用不同浓度消化酶和孵育时间从肝癌组织中得到的sEVs质量,建立了不同存储状态下肝癌组织来源的sEVs的分离和纯化方法,包括组织间隙来源的sEVs（tissues-derived sEVs,tdsEVs）和培养的外植体来源的sEVs（cultured explants-derived sEVs,cedsEVs）。纳米流式细胞仪（Nano-flow cytometry,Nano FCM）显示,我们建立的方法（方法3,在差速超速离心法上改进的方法）获得的tdsEVs比用差速超速离心法得到的tdsEVs纯度更高。因此,我们的研究建立了一种简单有效分离高质量sEVs的方法,并确定了肝癌组织sEVs分离富集的最佳实验条件,这些结果将为组织sEVs研究提供重要的数据和方法学支持。目的:1.探讨高质量s EV的富集方法。2.确定用于人类肝癌组织sEVs分离的最佳条件。3.探讨方法3（改良的差速超速离心法）提取的tdsEVs是否具有生物活性。方法:1.通过Nano FCM检测在不同浓度的消化酶（胶原酶D:1,2,4 mg/ml;脱氧核糖核酸酶I（Deoxyribonuclease I,DNase I）:20,40,80 U/ml）和孵育时间（20,30min）的组合条件下通过三种方法（方法1:差速超速离心法;方法2:方法1+0.22μm过滤;方法3:方法2+两步差速离心步骤）提取的tdsEVs的颗粒浓度、蛋白含量和纯度。2.通过Nano FCM和蛋白免疫印迹（Western blot）检测在不同浓度的消化酶和孵育时间组合条件下通过方法3提取的tdsEVs中CD9和CD63的表达情况。3.用20（1）组合条件（胶原酶D（4 mg/ml）、DNase I（80 U/ml）和孵育时间（20min））下通过方法3获得的tdsEVs进行人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs）的摄取试验和划痕试验。4.通过Nano FCM和Western blot对三种不同来源的sEVs（cedsEVs、新鲜和冷冻的tdsEVs）进行数量（粒子浓度和蛋白含量）、粒径、质量（纯度和形态外貌）以及蛋白标志物的分析。5.应用Graph Pad Prism软件,采用One-way ANOVA和unpaired two-tailed Student’s t test进行统计学分析。结果:1.通过方法3提取的tdsEVs纯度高、变异系数（Coefficient of Variation,CV）%值低,而通过方法1和方法2提取的tdsEVs纯度低且方法1获得的s EV的CV%值高。2.在20（1）组合条件下通过方法3获得的tdsEVs蛋白标志物CD9含量最高而CD63的含量与其他组合相比没有显著性差异。3.在20（1）组合条件下通过方法3获得的tdsEVs能够被HUVECs摄取,划痕实验表明tdsEVs能够抑制HUVECs的迁移速率。4.与培养组织相比,新鲜组织获得的sEVs在颗粒数量和蛋白质含量显著提高,且颗粒粒径分布和纯度更好。然而,新鲜和冷冻状态组织获得的sEVs在前述四个因素方面没有显著性差异。5.Nano FCM和Western blot显示培养组织获得的sEVs中CD63阳性sEVs的比例及CD63的含量显著高于新鲜和冷冻组织来源的sEVs。6.Western blot表明新鲜和冷冻组织来源的sEVs中CD9、TSG101和HSP70的蛋白含量明显高于培养组织来源的sEVs。7.考马斯亮蓝染色显示tdsEVs比cedsEVs的总蛋白含量更高。结论:我们开发了一种简便的sEVs分离富集方法,并优化了从肝癌组织中分离和纯化sEVs的条件。我们的数据表明,最佳组合（4 mg/ml的胶原酶D、80 U/ml的DNase I和20 min的孵育时间）是从肝癌组织中分离出高质量sEVs的关键因素。