论文部分内容阅读
房水（Aqueous humor,AH）是由后房睫状突产生,经小梁网（trabecular meshwork,TM）-史莱姆（Schlemm,SC）管通路和葡萄膜巩膜（uveoscleral）通路,外排至巩膜静脉。房水产生和流出的动态平衡对于眼内压（intraocular pressure,IOP）的维持至关重要。房水外排阻力增大是导致眼内压升高以及原发性开角型青光眼的关键致病原因。因此,保证正常的房水外排是维持眼内压的重要手段。小梁网是调控小梁网-Schlemm管房水外排的关键组织;睫状肌对于葡萄膜巩膜途径的房水外排至关重要。课题组前期研究已经证明,机械敏感离子通道Piezo在房水循环通路的小梁网和睫状肌中高表达,并初步阐明Piezo参与了房水循环,改变了房水动力学参数,推测Piezo可能与房水外排密切相关。因此,明确Piezo在调控房水外排中的关键作用将对青光眼的降眼压治疗意义重大。研究目的:基于自主研发的Syringe-pump系统,参考i Perfusion系统的离体眼球房水测定的新理论自主修正Goldman Equation,探究Piezo感知眼压、传递力学信号、调节房水动力学参数的作用,进而明确Piezo调控小梁网-Schlemm管与葡萄膜巩膜房水外排的作用,最终为基于Piezo治疗青光眼的新药研发提供理论依据。研究方法:针对Piezo调控葡萄膜巩膜房水外排,采用免疫荧光方法,确定Piezo在C57 BL/6J葡萄膜巩膜房水外排通路组织中的表达情况;借助药物学手段（Piezo 1的激动剂Yoda 1和机械敏感离子通道的抑制剂Gs TMx4）,调控Piezo功能;通过示踪法,前房灌注PBS、TMRD-PBS、Yoda 1-TMRD-PBS、Gs TMx4-TMRD-PBS,借助组织切片技术和激光共聚焦显微镜,定量分析葡萄膜巩膜房水外排通路组织中的荧光强度,评价Piezo对葡萄膜巩膜房水外排的影响。针对Piezo调控小梁网-Schlemm管房水外排,C57 BL/6J小鼠前房注射乳胶微球（beads）,模拟病理状态高眼压,并利用Tonometer实时监测眼压;借助Syringe-pump系统,准确测定离体高眼压眼球房水流畅系数（Cr）;灌注Yoda 1,分析Piezo对小梁网-Schlemm管房水外排的作用;通过LC-MS/MS分析,分析正常培养小梁网细胞、20%循环式拉力处理组、20%循环式拉力和Gs TMx4处理组,阐明机械敏感通道（CMCs）在调节人源小梁网细胞（HTMCs）应对机械力的作用。研究结果:1.Piezo 1、Piezo 2高表达于睫状肌、小梁网。2.荧光示踪剂Tracer-TMRD在睫状肌的荧光强度随灌注后存活的时间减弱;灌注后30 min、60 min、90 min时荧光强度比较结果:均为实验组（Yoda 1-TMRD-PBS）较对照组（TMRD-PBS）的荧光强度显著提高;灌注后120 min时,各组荧光强度无显著差异。灌注后60 min内,各组荧光强度比较结果:Yoda 1-TMRD-PBS组＞TMRD-PBS组＞Gs TMx4-TMRD-PBS组＞PBS组。由此提示:Piezo 1的激活促进葡萄膜巩膜途径的房水外排速率,包括Piezo在内的机械敏感离子通道的功能抑制降低葡萄膜巩膜途径的房水引流速率。3.前房注射beads引发高眼压,其房水流畅系数较正常组显著降低;通过比较病理状态下PBS组与Yoda 1组的房水流畅系数:灌注PBS组的房水流畅系数为16.0±1.2 n L/min/mm Hg（n=9）,灌注Yoda 1组的房水流畅系数为21.0±0.5n L/min/mm Hg（n=11）,两组的房水流畅系数Cr值存在显著性差异,且Yoda 1房水流畅系数比PBS组高（4.0 n L/min/mm Hg）20%～45%。4.机械敏感通道调控人源小梁网细胞应对机械变化,其下游信号包括:钙信号、细胞骨架重塑、自噬、细胞周期和细胞命运。研究结论:1.Piezo在房水外排的葡萄膜巩膜途径和小梁网-Schlemm途径的组织中均有表达,且在关键部位睫状肌和小梁网有表达。2.Yoda 1通过激活Piezo 1的功能,可以调节睫状肌的生理功能,促进葡萄膜巩膜途径房水的外排;Gs MTx4抑制包括Piezo在内的机械敏感离子通道,进而抑制葡萄膜巩膜通路的房水引流功能。由此提示,Piezo 1在葡萄膜巩膜房水外排途径中发挥积极作用。3.在病理状态下,Yoda 1激活Piezo 1,可改善小梁网房水外排能力,促进小梁网-Schlemm管途径房水的外排。由此推测,通过调控Piezo,可能促进青光眼患者小梁网房水外排,从而实现眼压的降低达到治疗效果。4.在HTMCs受到机械拉伸时,Ca2+稳态、自噬、细胞周期和细胞命运相关的差异性蛋白可能是CMCs适应机械力、促进房水流出的关键下游信号。5.通过证实Piezo对房水外排的促进作用,提示Piezo可能成为治疗青光眼的潜在新靶点,为发现治疗青光眼药物提供了新的思路,并推动了药物靶标治疗青光眼高眼压领域的进展。