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小麦茎基腐病（Fusarium crown rot of wheat）是一种重要的世界性土传病害,假禾谷镰孢（Fusarium pseudograminearum,Fp）是我国黄淮麦区小麦茎基腐病的优势病原菌,随着全球气候变暖及秸秆还田等耕作方式的改变,目前该病害呈不断蔓延和为害加重的趋势,严重影响小麦生产和国家粮食安全。国外报道假禾谷镰孢菌在自然条件下子囊壳产生不仅少见而且育性很低,但在我国5月中旬小麦灌浆期,假禾谷镰孢在田间产生子囊壳不仅数量多,而且成熟子囊和子囊孢子的形成比率很高,表明有性生殖在其整个生活史中具有重要作用,目前国内关于假禾镰孢在田间有性生殖和相关基因的功能的报道很少,基于此,本研究在五月中旬小麦灌浆期至玉米收获期,从河南开封和焦作田间调查采集小麦茎基腐病样和13份小麦茬上带子囊壳的病样在室内进行单子囊孢子分离培养,获得纯化菌株327个,用形态学和分子生物学方法鉴定均为假禾谷镰孢,交配型MAT1-1和M4T1-2各有164株和163株。对国外报道假禾谷镰孢的有性态诱导方法进行了改进和优化,用互补交配型的子囊孢子后代在Sachs合成固体培养基配以水稻茎节对峙培养,在黑光灯和冷白光灯交替光照及22℃条件下,温箱培养60 d左右,在水稻茎节处产生大量子囊壳和成熟子囊孢子。同时,获得的高育性假禾谷镰孢菌株KF-86和KF-73用于后续遗传转化实验。在丝状真菌中已有很多对交配型（MAT）位点基因功能的研究,为了验证MAT基因在假禾谷镰孢中的功能,本研究采用反向遗传学的研究思路,利用Spilt-marker同源替换的基因敲除策略,通过PEG介导的原生质体转化法,将假禾谷镰孢的5个MAT基因敲除。用四对引物和Southern blot验证所得到的转化子,最后获得所有MAT基因敲除突变体。酵母双杂实验表明,FpMat1-1-1 与 FpMat1-2-1 和 FpMat1-1-3 互作;FpMat1-2-1 还与 FpMat1-2-3 和FpMat1-1-3互作;对MAT1-1-3-FLAG的pull-down分析结果进行酵母双杂交验证,FpMat1-1-3能与FPSE 06440编码的线粒体ATP合成酶互作。与野生型相比,ΔFpmat1-1-1、ΔFpmat1-1-2和ΔFpmat1-2-3突变体对生长和致病力没有影响,但ΔFpmat1-1-3和ΔFpmat1-2-1突变体在表型和致病力上有显著差别。ΔFpmat1-1-3和ΔFpmat1-2-1突变体菌落生长速度缓慢,气生菌丝缺乏,菌落出现明显的角变现象。ΔFpmat1-2-1突变体在CMC中产孢量显著下降,分生孢子萌发速度明显减慢。特别的是,ΔFpmat1-1-3突变体在PDA、SNA和CMC固体培养基上产孢量显著提高,形成很多的分生孢子座;ΔFpmat1-2-1突变体菌丝融合能力显著降低,孢子长度极显著增加,在PDA、SNA和CMC固体培养基上产孢量与野生型没有显著差异。玻璃纸穿透实验表明FpMAT1-1-3和FpMAT1-2-1基因缺失减弱了假禾谷镰孢穿透寄主的能力。菌饼接种大麦叶片和小麦胚芽鞘以及盆栽实验表明ΔFpmat1-1-3突变体致病力显著下降,但用ΔFpmat1-1-3突变体孢子悬浮液接种剪伤的胚芽鞘,致病力与野生型没有差异,这与田间穗部接种结果相同。Δ Fpmat1-2-1突变体菌饼接种胚芽鞘不致病,与盆栽实验和田间穗部接种结果一致,即使孢子悬浮液接种剪伤的胚芽鞘也只能造成接触点病斑,侵染菌丝在胚芽鞘细胞中生长畸形,扩展受阻。DAB染色和组织细胞观察表明,ΔFpmat1-2-1突变体孢子侵染早期,侵染菌丝不能躲避寄主的防卫反应,诱发寄主产生大量ROS,抑制侵染菌丝扩展。Δ Fpmat1-1-3突变体对H2O2和SDS耐受性增强,一定浓度下的NaCl和Sorbitol胁迫反而促进菌落生长,刚果红等逆境条件能恢复菌落扇形突变。自身启动子驱动的野生型FpMAT1-1-3基因回补了ΔFpmat1-1-3突变体表型,MAT1-1-3-GFP融合蛋白主要定位在细胞质。对Flag-MAT1-1-3的Pull-down结果进行酵母双杂交验证,FpMat1-1-3能与FPSE＿06440编码的线粒体ATP合成酶互作。ΔFpmat1-2-1突变体对H2O2和SDS敏感,对NaCl、KC1耐受性显著增加,山梨醇和刚果红能显著促进突变体气生菌丝生长。超量表达MAT1-2-1-GFP,融合蛋白绿色信号与DAPI染色荧光信号共定位在细胞核。室内杂交实验表明,除了Δ Fpmat1-1-2突变体能产生形态异常的子囊孢子,其它交配型位点基因缺失突变体分别与不同交配型的野生型菌株杂交都不能产生成熟的子囊孢子。有趣的是,ΔFpmat1-1-3突变体能在水稻秆上产生大量的子囊壳,且显著地促进子囊壳的形成时间和数量。综上所述,本研究在田间广泛采集子囊壳样品,在室内分离子囊孢子后代,鉴定都是假禾谷镰孢,利用子囊孢子后代进行室内有性杂交实验,改进诱导假禾谷镰孢产生子囊壳的培养条件,获得高育性菌株。假禾谷镰孢所有MAT基因对有性生殖都有重要作用。ΔFpmat1-1-3和ΔFpmat1-2-1突变体对生长、产孢和致病力都有显著影响。有趣的是,FpMT1-1-3基因负调控子囊壳的产生和分生孢子的数量。本研究对假禾谷镰孢菌交配型基因功能研究,为探究假禾谷镰孢的有性生殖的分子机制提供理论基础。