研究背景肾细胞癌(Renal cell carcinoma,RCC)是一种常见的泌尿系统恶性肿瘤,主要起源于肾小管上皮细胞,具有高度的异质性。其发病率在成人中约占全身恶性肿瘤的2%-3%。肾细胞癌有多种病理分型,包括肾透明细胞癌、乳头状癌、嫌色细胞癌等,其中肾透明细胞癌最为常见。RECQ1(RECQL、RECQL1)解螺旋酶是RECQ家族中表达量最高的成员,主要功能是促进DNA双链的打开以及单链DNA的退火,同时,RECQ1还参与DNA损伤的修复、维护基因组稳定。目前,有部分研究证实,RECQ1的沉默具有抑制多种恶性肿瘤细胞增殖、成瘤、侵袭、转移及上皮-间质转化等生物学行为,然而其在肾细胞癌中的表达情况及其与肾细胞癌生物学行为的关系尚未见文献报道。随着RNA干扰(RNA-interference,RNAi)技术日渐成熟,其在分子生物学领域得到了广泛的应用,可使用si RNA、质粒或者是以慢病毒为载体对细胞进行转染,以特异性的降解某一种m RNA,使得该基因的表达得以下调。慢病毒载体源于逆转录病毒,经过一系列的改造,删除了HIV-1的致病序列,具有良好的安全性和很高的感染效率,可以携带较长的RNA片段,并将目的序列整合入宿主的基因组中,在细胞实验中得以广泛的应用。在人类基因组计划后,转录组学、蛋白质组学以及糖组学等组学研究得到了迅猛的发展,。在新一代高通量测序技术的此基础上,高通量RNA测序(RNA-seq)得到了快速的发展。比较与以往所使用的基因芯片技术,RNA-seq免除了探针设计,具有高信号噪声比、高分辨率、数据量大等优势,为医学科研提供了理想的平台。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路在细胞增殖和分化中发挥重要作用。当受到各种细胞外刺激后,MAPK通路被激活,经过级联放大的信号转导后,MAPK发生磷酸化,包括细胞外信号调节蛋白激酶(ERK),c-Jun-NH2激酶(JNK)和p38 MAPK(p38)。研究显示,多种人类恶性肿瘤(包括RCC)的发生、侵袭、转移和血管生成过程中都存在MAPK信号转导通路的活化。已在多种人类肿瘤中检测ERK高表达或活性增强,包括乳腺癌,胶质母细胞瘤和源自肾,结肠和肺组织的原发性肿瘤细胞。在肾透明细胞癌中也存在MAPK通路的激活和MKK1、ERK2的高表达。上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition)是肿瘤细胞获得转移能力的关键过程。在EMT过程中,上皮细胞失去其顶-底极性,细胞间连接被破坏,并最终获得典型的间充质特征。E-cadherin和N-cadherin是反映EMT水平的关键生物标志物。E-cadherin水平的降低与N-cadherin水平的增加相平衡,表明细胞相互作用减弱并且肿瘤细胞的侵袭和迁移能力增强。多种信号通路参与肿瘤细胞的EMT过程,如转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β,Wnt和核因子(nuclear factor,NF)-κB通路等,其中,TGF-β是最主要的EMT相关信号通路。作为TGF-β途径的关键转录因子,Smad-3与Smad-2结合,然后在TGF-β受体激活后通过Smad-4转位进入细胞核。Smad-3调节下游基因和转录因子,如ZEB1,ZEB2,Snail和Twist等从而发挥促EMT作用。在本研究中,我们通过生物信息学分析、组织芯片、Western Blot和细胞免疫荧光,对RECQ1在肾细胞癌中的表达进行了研究。通过构建慢病毒载体,和细胞感染,在RCC细胞ACHN和786-O中构建了稳定的RECQ1下调模型。通过RNA高通量测序,探究了RECQ1下调对RCC细胞转录组的影响。通过CCK-8、平板克隆形成、裸鼠皮下种植瘤、划痕和Transwell等细胞功能实验,检测了RECQ1下调对RCC细胞生物学行为的影响,通过Western Blot检测了RECQ1下调对KRas-MAPK通路和TGF-β通路活性的影响。RECQ1在肾细胞癌中表达的研究第一部分目的:探究RECQ1在肾细胞癌组织和细胞中的表达水平方法:通过生物信息学方法分析TCGA数据库中RCC病例肿瘤组织中m RNA的表达水平。寻找RECQ1的相关基因,对相关基因进行基因本体分析和聚类分析,将相关基因绘制基因互作网络图,从而对RECQ1在RCC中的作用进行预测。对包含RCC组织和癌旁正常组织的组织芯片进行免疫组化染色,通过统计学方法,对RECQ1在RCC组织和癌旁正常组织的表达从蛋白水平上进行检测。通过Western Blot技术,对RECQ1在RCC细胞ACHN、786-O、769-P、A498以及肾小管正常上皮细胞HK-2中的表达进行检测和比较,通过细胞免疫荧光技术对RECQ1在RCC细胞ACHN和786-O中的定位进行检测。结果:生物信息学分析显示在RCC中与RECQ1相关,Pearson score>0.4的基因共1744个,RECQ1相关基因主要与细胞分裂、DNA复制、DNA转录、DNA修复以及小分子GTP酶活性等相关。通过对组织芯片进行免疫组化实验,在RCC组,RECQ1阳性病例数为:62例,阳性率为89.86%。在癌旁正常组织中,RECQ1阳性例数为28例,阳性率为48.28%。两组差异具有统计学意义(x2=22.95,p<0.001),在RCC组织中,表达量为++以上的有46例,占66.67%。在癌旁正常组织中,表达量为++以上的有19例,占32.76%。差异具有统计学意义(x2=14.50,p<0.001)。通过免疫印迹实验和免疫细胞荧光实验,我们发现RECQ1在RCC细胞系ACHN、786-O、769-P、A498以及肾小管上皮细胞系HK-2中均有表达,其定位于细胞核中。相比HK-2细胞系,RECQ1在四种RCC细胞系中均有不同程度的高表达结论:1.相比于癌旁正常组织,RECQ1在RCC组织中存在m RNA水平上高表达。2.RECQ1在RCC中的相关基因主要与DNA复制、DNA转录、DNA修复、小分子GTPase活性等相关。3.相比于癌旁正常组织,RECQ1在RCC组织中存在蛋白水平的高表达。4.相比肾小管上皮细胞HK-2,RECQ1在RCC细胞系ACHN、786-O、769-P以及A498中高表达,其在RCC细胞中定位于细胞核中。第二部分RECQ1下调对肾细胞癌细胞影响的转录组学研究目的:在RCC细胞中构建RECQ1稳定下调模型,并检测RECQ1下调对转录组的影响。方法:通过质粒转化、提取、慢病毒包装,构建了sh-RECQ和无关序列对照的慢病毒载体。使用慢病毒感染肾细胞癌细胞786-O和ACHN,通过G418筛选,构建RECQ1稳定下调细胞株。通过RT-q PCR和Western blot技术检测RECQ1的敲低效率。将786-O细胞的NC和sh-RECQ1转染细胞株进行RNA提取,进行高通量RNA测序。结果:在慢病毒感染后,两种细胞中均稳定表达荧光蛋白。RECQ1在两种细胞系中的m RNA和蛋白表达水平均显著下降。使用786-O细胞建立的NC和sh-RECQ1模型所进行的测序数据质量良好。相对于NC组样本,sh-RECQ1组中表达量降低超过50%(log2≤-1)的基因共有1279个,表达量上升超过一倍(log2≥1)的基因有1152个。GO分析显示这些下调的基因的功能主要富集在GTP酶的结合、小分子GTP酶活性调节、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性、细胞运动等方面。KEGG通路分析显示,RECQ1下调主要抑制了MAPK、VEGF、TGF-β及m TOR等信号通路。结论:1.RECQ1低表达稳定细胞株构建成功,为后续研究提供良好的基础。2.RECQ1的下调可引起多种基因在m RNA水平上的上调或下调。3.RECQ1的下调可抑制多条肿瘤细胞增殖、侵袭及EMT相关的信号转导通路,所以RECQ1可以作为抗肿瘤治疗的潜在靶点。第三部分RECQ1下调对肾细胞癌生物学行为的影响及其机制研究目的:研究RECQ1下调对肾细胞癌增殖、侵袭、迁移、EMT等生物学行为的影响以及其分子机制。方法:使用肾细胞癌细胞系ACHN和786-O构建RECQ1下调(sh-RECQ1)和无关序列对照(NC)的稳定细胞株。使用CCK-8细胞活力实验和平板克隆形成实验检测细胞的增殖能力,使用划痕实验和Transwell迁移实验检测细胞的迁移能力,通过Transwell检测细胞的侵袭能力,通过裸鼠皮下种植瘤实验检测细胞的成瘤能力,通过Western Blot技术检测RECQ1下调对细胞上皮-间质转化的影响以及MAPK、TGF-β通路的活性。结果:在两种细胞系中,相比较于NC组,sh-RECQ组细胞增殖速度减慢,增殖曲线在72h起差异具有统计学意义。通过克隆形成实验可观察到,RECQ1的敲低可以显著降低RCC细胞的克隆形成能力,差异具有统计学意义。通过划痕实验及Transwell迁移试验,我们发现,在两种RCC细胞系中,RECQ1的敲低均可使划痕愈合比例减少、穿膜细胞数明显减少,说明RECQ1的敲低可以抑制RCC细胞的迁移能力。通过Transwell侵袭实验,我们发现在以Matrigel包被的情况下,RECQ1敲低使得穿膜细胞数显著减少,同时,通过Western blot检测金属蛋白酶(MMP-2/9)的表达也明显降低,说明RECQ1敲低可以抑制RCC细胞的侵袭能力。在两种RCC细胞系中,相对NC组,sh-RECQ1组K-RAS表达量显著减少,C-RAF,MEK1,ERK1/2的表达没有明显变化,但p-RAF、p-MEK、p-ERK1/2显著降低,说明RECQ1的敲低显著抑制了KRas-MAPK通路的活性。在sh-RECQ组细胞中,E-cadherin的表达量明显上升,间质标志物N-cadherin表达量明显下降,EMT相关转录因子Snail1及ZEB1表达量明显下降,Smad3表达水平无明显变化,但p-Smad3表达降低。结果说明RECQ1的敲低可以抑制RCC细胞的EMT,且这种抑制作用可能是通过抑制TGF-β信号通路的转导实现的。结论:1.RECQ1下调可抑制RCC细胞的增殖和成瘤能力。2.RECQ1下调可抑制RCC细胞的侵袭、迁移能力。3.RECQ1下调可抑制KRas-MAPK通路的活性。4.RECQ1下调可抑制RCC细胞的上皮-间质转化。5.RECQ1下调可抑制TGF-β通路的活性。