【摘 要】
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目的:探究榆干离褶伞溶栓酶（Lyophyllum ulmarium fibrinolytic enzyme,LUFE）对过氧化氢（H2O2）所致人脐静脉内皮细胞（HUVEC）损伤的保护作用及其机制。方法:将HUVEC分为正常对照组,模型组,LUFE低、高剂量组。使用900μmol/L H2O2建立细胞氧化损伤模型。CCK8法检测细胞活力,TBA法检测丙二醛（malonaldehyde,MDA）水平
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目的:探究榆干离褶伞溶栓酶（Lyophyllum ulmarium fibrinolytic enzyme,LUFE）对过氧化氢（H2O2）所致人脐静脉内皮细胞（HUVEC）损伤的保护作用及其机制。方法:将HUVEC分为正常对照组,模型组,LUFE低、高剂量组。使用900μmol/L H2O2建立细胞氧化损伤模型。CCK8法检测细胞活力,TBA法检测丙二醛（malonaldehyde,MDA）水平,磷酸铵法检测过氧化氢酶（catalase,CAT）活性,WST-8法检测超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2,SOD2）活性,比色法检测谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-PX）活性和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）水平,免疫荧光法观察细胞及线粒体活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平以及线粒体跨膜电位水平,流式细胞术检测细胞凋亡率,蛋白免疫印迹方法观察细胞核因子相关因子2（nuclear factor erythroid 2-relted factor,Nrf2）、血红素加氧酶1（heme oxygenase 1,HO-1）、NADPH醌氧化还原酶1（NAD（P）H-quinone oxidoreductase 1,NQO1）、沉默信息调节因子3（silent information regulator 3,Sirt3）、Kelch样ECH关联蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein1,Keap-1）、B细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemias-2,Bcl2）、Bcl 2相关蛋白X（Bcl2 associated x protein,Bax）、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶9（cysteine aspartic acid specific protease 9,caspase 9）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase 3,caspase 3）蛋白表达水平。加入Nrf2抑制剂ML385后,将HUVEC分为正常对照组、模型组、ML385组、LUFE组、LUFE+ML385组。采用蛋白免疫印迹观察细胞内Nrf2、Sirt3蛋白表达情况,WST-8法检测SOD2活性。结果:1.LUFE抑制H2O2诱导的细胞凋亡:CCK8结果表明,LUFE抑制H2O2所致细胞存活率的降低,并明显减少H2O2诱导的细胞凋亡。免疫印迹结果表明,LUFE上调Bcl2蛋白表达水平并下调Bax、cleaved-caspase 9、cleaved-caspase 3蛋白表达。2.LUFE对H2O2所致细胞氧化损伤有保护作用:LUFE逆转H2O2诱导的细胞及线粒体ROS水平的升高以及线粒体跨膜电位的下降,并提高抗氧化酶SOD2、CAT、GSH-PX的活力、提高ATP水平,同时降低MDA水平。免疫印迹结果显示,LUFE可以上调氧化应激损伤后细胞的Nrf2、HO-1、NQO1、Sirt3蛋白表达水平并下调Keap-1蛋白水平。以Nrf2抑制剂ML385处理后检测Nrf2、Sirt3蛋白表达水平和SOD2活性,结果表明,LUFE可通过调节Nrf2上调Sirt3蛋白水平,提高SOD2活性。结论:LUFE可能通过调控Nrf2/Sirt3信号通路减轻H2O2诱导的血管内皮细胞氧化损伤,减少细胞凋亡,从而保护血管内皮细胞。
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