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目的:绝大多数肿瘤通过抑制Caspase的上游信号途径而不是通过直接灭活凋亡途径中的Caspase来避免凋亡的,说明这些Caspase可能在肿瘤的发生发展过程中起了重要作用。我们开发了可在细胞中实时监测Caspase活性的分子工具,并在乳腺肿瘤细胞中进行筛选,发现Caspase-3/7存在有限的活化,且它们对乳腺肿瘤细胞的生长是必须的。本课题旨在研究乳腺肿瘤细胞控制Caspase-3/7的有限活化的机制及其在乳腺肿瘤发生及发展过程中的作用。方法:构建相关质粒,扩增质粒,制备慢病毒,构建稳定细胞系。培养细胞,将细胞分为实验组和对照组,采用细胞计数和软琼脂克隆形成实验检测Caspase-7表达水平对MCF-7细胞生长速度、增殖能力及克隆形成能力的影响。Western blot技术检测Caspase-7等蛋白的表达水平。用Caspase-7抑制剂Z-DEVD处理MCF-7细胞,采用细胞计数和软琼脂克隆形成实验,观察抑制剂对MCF-7细胞生长速度、增殖能力及克隆形成能力的影响。TNFα作用诱导细胞凋亡。无糖DMEM培养液培养细胞,观察MCF-7/vector、MCF-7/caspase-8DN对无糖刺激时的生长存活能力。AT101刺激细胞,观察Caspase-8、7与线粒体膜通透性之间的关系。结果:1、乳腺肿瘤细胞中存在有限活化的Caspase。2、Caspase-3/7对乳腺肿瘤细胞的生长是必须的。抑制Caspase-3/7的活性能抑制MCF-7细胞anchorage-dependent和anchorage-independent的细胞生长。3、Caspase-3/7有助于提高乳腺肿瘤细胞对周围代谢微环境的适应性。4、Caspase-3/7在乳腺肿瘤细胞能量生成中发挥着非常重要的作用,抑制Caspase-3/7的活性明显抑制MCF-7细胞ATP的产生。5、可控活化的Caspase-3/7可能是由caspase-8激活的,但微量活化的Caspase-7又不会导致细胞凋亡。表达Caspase-8DN的MCF-7细胞自发存在少量细胞的凋亡,但是能抑制TNFα诱导的细胞凋亡。6、Caspase-8能提高乳腺肿瘤细胞的能量代谢速率。7、低剂量的AT101能促进MCF-7/Caspase-8DN大量凋亡。结论我们的研究表明在在乳腺肿瘤细胞MCF-7中存在Caspase-7的少量活化,这种活化是可控制的,而且为细胞生长增殖所必须,软琼脂实验显示Caspase-7对MCF-7的克隆形成能力也是必须的,提示Caspase-3/7有可能在乳腺肿瘤的转移及恶化过程中发挥着重要作用。Caspase-3/7在乳腺肿瘤细胞的葡萄糖代谢中还发挥着重要的调节作用,在低葡萄糖及高乳酸的条件下,抑制Caspase-3/7的活性能迅速杀死MCF-7乳腺细胞,提示Caspase-3/7有助于提高乳腺肿瘤细胞对周围代谢微环境的适应性。另外抑制Caspase-3/7的活化能够抑制乳腺肿瘤细胞ATP的产生,提示Caspase-3/7在乳腺肿瘤细胞能量代谢中发挥着非常重要的作用。有限活化的Caspase-3/7可能是由Caspase-8激活,Caspase-8可能作用于线粒体膜,使其膜通透性增强,但不形成广泛的MOMP,激活少量的Caspase-7,有限活化的Caspase-7虽不导致细胞凋亡,但是对乳腺肿瘤细胞生存和转移以及应对不利的代谢微环境方面起着重要的作用。