酱油发酵基料,是酱油酿造产生的主要副产物,一般呈深棕色,通常又被简称为酱油渣。其产量十分巨大,据统计广东省每年就会产生150 t以上;酱油发酵基料中还含有大量的油脂、膳食纤维、大豆异黄酮等活性物质,具有很高的回收价值。但是由于发酵的高水高盐环境使得其中残留的油脂和纤维结合紧密,难以去除,限制了其他成分的利用,同时油脂已发生水解,酸价升高,游离脂肪酸含量较高,不能直接利用,造成了很大的资源浪费和环境污染。基于这些问题,本课题利用实验室自主研发低温连续相变萃取技术对酱油发酵基料的有效成分进行提取分析,以实现综合利用;同时,利用固定化酶技术对提取出来的油脂中游离脂肪酸合成1,3-甘油二酯（1,3-DG）,并对其中成分变化进行跟踪研究,开拓酱渣油脂的利用范围。通过研究达到提高资源利用率,同时解决酱油发酵基料对环境产生的危害问题。主要研究内容及结果如下:（1）不同厂家原料对比分析。对比了国内三家酱油生产公司的酱油发酵基料的主要成分,发现其采用的生产工艺不同,得到的酱油发酵基料质量也不相同。其中公司C的酱油发酵基料水分和盐分含量最高（分别达51.42%和25.71%）;公司B的酱油发酵基料油脂含量最多,占干基的38.43±0.43%;公司A的酱油发酵基料的盐分最低（干基含量10.91%左右）,纤维含量最高,其酱油发酵基料经过压榨工艺,含水量低,灰分杂质较少,而且其每年产量最大,选择其作为主要原料进行后续实验。（2）酱油发酵基料油脂的提取与精炼。相比于传统索氏抽提,低温连续相变萃取油脂得率平均高出3%左右,干基提取率可达96.60%⁹9.31%。且连续相变的萃取时间短,时间仅需45 min,在低温45℃下进行,溶剂残留低,优势明显。对比低温连续相变萃取三种溶剂形式下的油脂得率,发现以直接用丁烷提取效果最佳（湿基下提取油脂得率可达19.46%）;对萃取出的油脂理化指标进行分析测定,发现其水分及挥发物、不溶性杂质、POV、碘值和皂化值等指标基本都在国标范围内,但酸值达123mgKOH/g严重超标。针对酱渣萃取油脂高酸值问题,对比直接加碱、乙醇萃取、分子蒸馏和酶法酯化脱酸四种方法,其中酶法酯化脱酸效果最佳,不仅不会造成油脂的损耗,而且反应条件温和。在固定化脂肪酶RM IM催化下,仅需要反应11 h,就可以将酱渣萃取油的酸值从121.38 mg KOH/g下降至3.47 mgKOH/g,降幅达97.14%。（3）酱油发酵基料中的大豆异黄酮研究。利用85%乙醇常规下提取、HPLC进行定性定量分析,发现酱油发酵基料中的大豆异黄酮主要还残留在渣滓中,含有3种游离苷元形式的大豆素（daidzein）、黄豆黄素（glycitein）、染料木素（genistein）和1种糖苷型的染料木苷（genistin）这四种组分,主要以活性更高的游离苷元形式存在。相比未发酵大豆,少了大豆苷（daidzin）和黄豆黄苷（glycitin）两种组分;但是酱油发酵基料中大豆异黄酮的总量为0.3586%,是未发酵大豆中异黄酮含量的2.62倍。利用低温连续相变,以乙醇为溶剂可以实现脱脂渣中大豆异黄酮的高效提取,其提取率随着乙醇浓度的增加而增大。95%乙醇低温连续相变萃取2 h,其提取率可达96.02%。（4）酱油发酵基料中的酱油酮分析。低温连续相变萃取出的酱渣油脂中存在两种形式的酱油酮（5-乙基-4-羟基-2-甲基-3（2H）-呋喃酮;2-乙基-4-羟基-5-甲基-3（2H）-呋喃酮）,总含量为242.25 ppm。（5）高酯化活性脂肪酶固定化研究。以酯化率为指标,筛选出高酯化活性的脂肪酶003（Aspergillus niger）,然后以大孔树脂为载体进行固定化工艺优化,最终得到大孔树脂A制备固定化脂肪酶00S的最优工艺条件为:缓冲液p H 7.5、离子强度为0.075 M、酶:树脂添加比例为1:1.3、固定化温度30℃、吸附时间4 h。通过上述条件下制得的固定化脂肪酶00S酯化活力达865.12 U/g,固定化率达94.32%,2 h的酯化率可达57.04%。固定化后酶的最适温度由40℃提高到65℃,酯化活力提高30%,重复使用10次后仍然保持有初始酶活力的91.56%,具有较好的操作稳定性。（6）固定化酶00S催化酱油发酵基料萃取油脂合成1,3-DG中的应用研究。考察了酶添加量、甘油添加量、反应温度、反应时间以及脱水方法对自制固定化脂肪酶00S催化酯化反应的影响。结果发现:当甘油添加量等于游离脂肪酸理论形成甘油二酯的1.2倍、反应温度65℃、脂肪酶的添加量为1%、反应过程中边抽真空边通氮气时,酯化效果最佳。另外,不同的金属离子对固定化脂肪酶00S有不同的影响:在2 mmol/L浓度时Ca²⁺、K⁺、Ba²⁺、Mg²⁺表现出激活作用,其中以K⁺激活作用最佳（2 h酯化率可达到70.35%）;Zn²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺表现出抑制作用,其中以Fe²⁺抑制作用最强。对酯化反应后产物分析,发现酶法催化酯化反应不会改变油脂的脂肪酸组成,酯化前后酱渣油脂脂肪酸组成均在大豆油国标范围内;酯化过程中,随着反应时间的增加、油脂的酸值逐渐降低,游离脂肪酸（FFA）含量逐渐减少,生成相应的甘油酯。通过GC-MS分析,脱酸油中各甘油酯组分含量为:TG（39.80%）、1,3-DG（43.65%）、1,2-DG(5.00%、MG（9.31%）、FFA（2.24%）。