论文部分内容阅读
目的：探讨何首乌提取物抑制大肠癌LoVo细胞生长的机制，为其预防及治疗大肠癌提供理论基础。 方法：本实验应用Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测不同浓度的何首乌提取物对人类大肠癌LoVo细胞的增殖抑制作用。收集指数期生长期的大肠癌LoVo细胞，铺96孔板，各孔加LoVo细胞悬液200μl。在5％CO2，95％O2，37℃培养箱6h，待细胞完全贴壁后，更换无血清培养液后继续培养12 h。观察各孔细胞状态，各孔更换新的无血清细胞培养液，依次加入不同浓度(终浓度为0、50、100、150、200μg/ml)的何首乌提取物200μl，每个加药浓度设6个复孔，分别继续培养24h、48h。至药物作用时间，弃培养液，每孔加新无血清培养液180μl/孔。每孔加入20μl CCK-8溶液。同时设置调零孔。避光，在细胞培养箱孵育1h。取450nm测定各孔的吸光度。结果用3组独立实验数据均数±标准差表示，计算细胞的半数抑制率（IC50值），并绘制细胞的生存曲线。Western blot法检测加入何首乌提取物前后大肠癌LoVo细胞中内源性脂肪酸合成酶(FAS)的表达。分别提取加入何首乌提取物后培养的LoVo细胞及未加何首乌提取物的LoVo细胞，提取细胞总蛋白。进行蛋白的浓度测定后，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，切胶，转膜，封闭，曝光，洗膜，显色，通过图像分析系统扫描分析，最后进行拍照。Reverse Transcription PCR(RT-PCR)法检测加入何首乌提取物前后大肠癌LoVo细胞中p21Cip1，p57Kip2基因的变化。提取加药前后的LoVo细胞的总RNA，将其逆转录为cDNA，进行PCR检测。扩增的产物进行电泳，使用凝胶图像分析系统采集图像并拍照记录。 结果：CCK-8结果显示何首乌提取物对人大肠癌LoVo细胞有明显的增殖抑制作用。何首乌提取物在一定的浓度范围和一定的作用时间范围内，对大肠癌细胞抑制作用有明显的浓度依赖性及时间依赖性。FAS表达的变化应用Western blot方法检测，结果显示何首乌提取物作用后的LoVo细胞中的FAS表达明显低于未给予何首乌提取物作用的LoVo细胞，并且FAS的表达随加入何首乌提取物的浓度增加，其表达逐渐下调。RT-PCR检测LoVo细胞中的p21Cip1，p57Kip2的变化，结果显示何首乌提取物作用后的LoVo细胞中的p21Cip1，p57Kip2的表达明显高于未给予相应作用的LoVo细胞，并且p21Cip1，p57Kip2的表达随加入何首乌提取物浓度的增加，其表达逐渐上调。 结论：何首乌提取物对大肠癌LoVo细胞增殖的抑制作用，具有浓度、时间依赖性;何首乌提取物抑制大肠癌LoVo细胞的生长可能是通过增强P21、P57的作用实现的;何首乌提取物通过抑制FAS，减少内源性脂肪酸的合成，从而减少大肠癌细胞生长增殖所需的物质，抑制大肠癌LoVo细胞的增殖;P21、P57与FAS表达之间可能存在关联性，即何首乌提取物可能通过抑制FAS，促进P21、P57的表达增加，抑制大肠癌LoVo细胞增殖。