基于宏转录组学北龙病毒分子生物学研究

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近年来,多种再发、突发及新发人类传染性病毒病的爆发,对人类的健康和社会的稳定造成了严重威胁。啮齿动物可以成为多种病毒的宿主和/或传染源,与人类接触密切。为监测和管理鼠源性病毒性流行病,调查啮齿动物中病毒的基线水平很有必要。北龙病毒(Beilong virus,BeiV),是副粘病毒科新近发现的Jeilongvirus属中的一员,目前仅在中国香港地区的褐家鼠和黑家鼠中发现,其宿主和地区分布认识有限。
  目的:
  (1)挖掘褐家鼠和黑线姬鼠的组织宏转录组基线信息;
  (2)拼接北龙病毒完整片段,获取北龙病毒的地理分布;
  (3)探究北龙病毒阳性筛选样本的遗传进化关系。
  方法:
  本研究对中国4个省的优势鼠种进行宏转录组测序,利用3’末端补齐实验和设计引物补齐拼接出北龙的完整序列。随后对4个省进行扩大的分子生物学筛选,采用RT-PCR和测序技术,对所有样本进行检测,绘制北龙与宿主分布地域相互关系的系统进化树,进行遗传分子生物学研究。
  结果:
  采集了来自北京市、山东省、广东省和河南省四个省份和直辖市的931只鼠类动物标本,随机将4个地区的优势鼠种(褐家鼠和黑线姬鼠)按照不同地区的相同鼠种初步混合成4个组织预混库,进行宏转录组测序。对获取的宏转录组进行生物信息学分析,每个预混库有15GB的高通量数据,所测得的原始序列数据量有574880865条,过滤带接头的、低质量的序列,以及宿主来源的序列,得到的过滤后数据量有54208309条,占比9.60%。与本地序列基本搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool,BLAST)序列数据库进行对比后,将匹配上的的病毒序列可划分为15个科,包括脊椎动物病毒10个科和植物病毒5个科。对931个样本进行北龙病毒的RT-PCR筛查,其中有89只啮齿目和小型哺乳动物阳性,超过10只阳性的鼠种有:褐家鼠(20只)、黑线姬鼠(19只)和臭鼩鼱(12只)。组织阳性率为3.60%(131/3656),对阳性鼠种和地区进行校正,多因素Logistic回归分析显示,以阳性率最低的心脏作为参照,脾脏、肾脏、肺脏的检测率明显较高。
  高通量测序获得了7条北龙病毒部分片段,然后利用3’末端补齐实验和设计引物补齐技术,拼接出一条完整的Rodent Beilong virus(Genebank:MT085491)序列。与5条先前存在的北龙病毒和同一个科的71种病毒序列采用最大似然法的L+G+F模型绘制L(large)蛋白的系统进化树,发现Rodent Beilong virus与5条北龙病毒片段具有同源性,主要分为两个主要谱系,两个谱系与它们的地理区域和动物宿主有关。
  结论:
  北龙病毒在中国自然特有的啮齿动物和小型哺乳动物的常见种类中广泛分布,脾脏、肾脏、肺脏阳性率较高,提示北龙病毒可引起动物宿主的全身性感染。系统
  发育分析揭示了北龙病毒的遗传多样性,与病毒的地理起源和动物宿主有关,表明病毒和宿主之间存在长期的协同进化关系。
  意义和创新性:
  本研究创新性引用宏转录组技术对我国优势鼠进行组织病毒组信息挖掘,为了解北龙病毒在自然界中的多样性和宿主范围提供了新的信息,突出了在更大范围内进行流行病学研究的必要性。本研究是我国检测北龙病毒的最大样本量,增加了对北龙病毒的阳性宿主的多样性的认识。
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