论文部分内容阅读
背景:胃癌(gastric cancer,GC)是一种常见的消化系统恶性肿瘤,其发病率和病死率均居于高位,且由于缺乏早期诊断的生物学标志物,胃癌病人确诊时多数处于晚期阶段,缺乏有效的治疗方案,预后较差,是严重危害人类生命健康的重大难题。胃癌的发生机制复杂,环境因素及遗传因素均参与其中。目前针对胃癌的发生机制及临床治疗已展开了部分研究,但关于胃癌发生发展的具体机制目前还未被完全阐明。进一步明确胃癌发生发展的确切生物学机制将有助于胃癌有效的早期诊断的生物学标志物的挖掘及寻找到有效的治疗靶点。环状 RNA(circular RNA,circ RNA)是一种新颖的非编码 RNA(non-coding RNA,ncRNA)。circ RNA独特的封闭式结构使其免受核酸外切酶的作用,可稳定存在于机体组织细胞中。circ RNA的功能多样,其可与mRNA竞争结合RNA结合蛋白(RBP)调节翻译,亦可调控选择性拼接与基因转录,或作为miRNA的分子海绵调控靶基因表达。近年来越来越多的circRNA被揭示可通过调节miRNA进而调节复杂分子网络,参与增殖、凋亡、侵袭、分化、衰老等多种生理和病理过程。随着高通量测序技术和生物信息学的快速发展,大量差异表达的circRNA被发掘,并被进一步证实参与可肿瘤的发生发展过程。研究证实circRNA被揭示通过竞争性结合miRNA进而调控下游靶基因参与了肺癌、肝癌、乳腺癌等多种肿瘤的发生及进展过程。然而circ RNA对胃癌发生发展的调控仍然较少,因此探讨circRNA在胃癌中的作用及机制尤为重要。目的:1.筛选胃癌中差异表达的circRNA;2.分析差异表达circRNA对胃癌细胞增殖、迁移、周期、凋亡等生物学性状的作用;3.预测并验证hsacirc0000051靶向结合的miRNA;4.检测miR-142-5p对胃癌细胞增殖、迁移的影响;5.验证hsacirc0000051/miR-142-5p对靶基因的调控及靶基因的功能。方法:1.通过GEO数据库搜索与胃癌相关的circRNA芯片数据,得到GSE100170,筛选差异表达的circRNA;2.通过Sanger测序和RNase R消化试验鉴别hsacirc0000051的特性3.QRT-PCR检测34例胃癌组织和癌旁组织及胃上皮细胞和胃癌细胞hsacirc0000051 的表达;4.在胃癌细胞系AGS和SGC-7901中转染hsacirc0000051的siRNA及过表达质粒,通过CCK8、克隆形成、Transwell及细胞划痕实验、流式细胞计数检测高低表达hsacirc0000051对细胞增殖、克隆形成、细胞迁移、周期及凋亡的影响。5.通过circinteractome预测与circRNA结合的miRNAs,后与胃癌相关的miRNA芯片结合分析,并通过QRT-PCR在细胞中验证,获得获取受hsacirc0000051调控的miRNA。6.利用数据库预测miR-142-5p靶点基因,并分析胃癌组织中hsacirc0000051、miR-142-5p及靶基因RHOA的表达相关性;7.构建 miR-142-5pmimic 和 inhibitor 转染细胞,通过 CCK8、克隆形成、Transwell及细胞划痕实验检测高低表达miR-142-5p对细胞增殖、克隆形成及细胞迁移能力的影响;8.构建hsacirc0000051和RHOA的野生型和突变型质粒,共转染miR-142-5pmimic以及对照,检测荧光强度;9.RNA结合蛋白免疫共沉淀实验验证hsacirc0000051与miR-142-5p的结合情况。10.QRT-PCR 及 western blot 检测转染 hsacirc0000051 siRNA、hsacirc0000051 siRNA+miR-142-5p inhibitor、miR-142-5p mimics、miR-142-5p mimics+RHOA 过表达质粒后RHOA的蛋白及mRNA的表达变化;11.转染 hsacirc0000051 siRNA,观察 hsacirc0000051 对胃癌细胞增殖、克隆形成及迁移的影响,同时共转染miR-142-5p inhibitor,观察miR-142-5p对hsacirc0000051的促进胃癌细胞增殖、克隆形成及迁移的影响;12.转染miR-142-5pmimic,观察miR-142-5p对胃癌细胞增殖、克隆形成及迁移的影响,同时共转染靶基因质粒,观察靶基因对miR-142-5p的抑制增殖、克隆形成及迁移作用的影响;结果:1.通过GEO数据库搜索与胃癌相关的circRNA芯片数据,得到GSE100170,该芯片共包含62998个circRNA,共207个差异表达的circRNA在,其中有57个上调和150个下调的circRNA,选取hsacirc0000051作为后续研究。2.hsacirc0000051 能够抵抗 RNase R 的消化,并,鉴定 hsa circ0000051 的环状特性。3.QRT-PCR结果提示hsacirc0000051在胃癌组织及胃癌细胞的表达显著高于和癌旁组织及胃上皮细胞。4.过表达hsacirc0000051促进细胞的增殖、克隆形成、迁移及细胞周期进程,并抑制凋亡,低表达hsacirc0000051抑制细胞的增殖、克隆形成、迁移、细胞周期及促进凋亡。5.生物信息学提示miR-142-5p可与hsacirc0000051,miRNA芯片提示在胃癌中低表达,其表达受hsacirc0000051调控。6.数据库预测RHOA为miR-142-5p的靶基因,胃癌组织中miR-142-5p与RHOA呈负相关,与hsacirc0000051呈负相关,hsacirc0000051与RHOA呈正相关;7.转染miR-142-5p过表达质粒可抑制胃癌细胞的增殖、克隆形成及迁移,转染miR-142-5p siRNA可促进胃癌细胞的增殖、克隆形成及迁移。8.共转染 miR-142-5p mimics 和 pGL3-RHOA 或 pGL3-hsacirc0000051 野生型质粒的细胞中,荧光显著减弱。在共转染miR-142-5p mimics和pGL3-RHOA或pGL3-hsacirc0000051突变型的细胞中,荧光活性未见明显变化。9.RNA结合蛋白免疫共沉淀实验显示AGO2蛋白结合的hsacirc0000051在miR-142-5pmimics处理的细胞中显著高于对照组,而与IgG结合的hsacirc0000051在miR-142-5pmimics组和对照组未见显著差异10.miR-142-5p inhibitor 可逆转 hsacirc0000051 siRNA 对 RHOA 的 mRNA 及蛋白表达的下调,RHOA过表达质粒能逆转miR-142-5p mimics对RHOA mRNA及蛋白表达的下调。11.转染hsacirc0000051 siRNA抑制细胞的增殖,克隆形成及细胞迁移能力。共转染miR-142-5p inhibitor可缓解hsacirc0000051 siRNA对细胞的增殖,克隆形成及细胞迁移能力的抑制作用。12.转染miR-142-5p mimics后,抑制细胞增殖,克隆形成及细胞迁移能力,共转染RHOA过表达质粒后可逆转miR-142-5p mimics对细胞的增殖,克隆形成及细胞迁移能力的抑制作用。结论:1.hsacirc0000051在胃癌中高表达。2.hsacirc0000051促进胃癌细胞的增殖、克隆形成、迁移、细胞周期及抑制凋亡。3.miR-142-5p 可与 hsacirc0000051 相结合4.miR-142-5p抑制胃癌细胞的增殖、克隆形成及迁移5.hsacirc0000051竞争性结合miR-142-5p,通过调控靶基因RHOA,参与胃癌的发生及进展。