骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤,常见患病人群为儿童、青少年和50岁以上的老年人,恶性程度高,进展快,早期转移,5年无病生存率低,给健康带来极大的威胁。20世纪70年代开始,随着辅助化疗和新辅助化疗理念在骨肉瘤治疗中的革新,骨肉瘤患者长期无病生存率从不足20%改善到65%-70%,然而近三十年过去了,骨肉瘤患者的长期无病生存率再也没有取得实质性进步,尤其是转移或者复发的骨肉瘤患者的5年生存率不足20%。骨肉瘤的分子生物学特征表现为:基因组不稳定,高频的染色质碎裂和超突变,很少携带有复发性可靶向的突变,这些都给研究带来了困难。进入21世纪出,随着人类基因组工程的完成,高通量的基因组分析方法的进步,包括c DNA克隆技术、芯片技术和转录组测序等快速发展,发现人类基因组中,只有大约2%的基因编码蛋白,剩下的基因大约70%-90%都进行转录,是非编码RNA序列。近十年大量的研究发现,非编码RNA的长链非编码RNA,不仅在细胞的正常发育、分化,而且参与多种疾病状态,包括在多种肿瘤中起重要的调节作用。长链非编码RNA FENDRR最初被发现特异性表达在发育中的小鼠胚胎中胚层组织,对于心脏、体壁、肺和其他多个器官的形成必不可少,并且参与胃癌和非小细胞肺癌的调控,表现为明显的抑癌作用,但是国内外并没有关于FENDRR在骨肉瘤中的功能研究。我们的课题在骨肉瘤临床组织标本、肿瘤细胞株、活体组织等三个层面,针对FENDRR对骨肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭和转移调控进行研究,并初步探讨其作用机制,为进一步临床应用提供理论依据。本研究具体内容包括以下部分:第一部分:FENDRR在骨肉瘤组织及细胞系中的表达及临床意义目的:检测FENDRR在骨肉瘤组织及细胞株中的表达水平,研究其表达水平差异及在骨肉瘤发展中的临床意义。方法:1、获取TCGA或者GEO数据库中关于骨肉瘤/肉瘤的芯片测序数据,和正常组织对比,使用聚类分析方法和软件对FENDRR表达模式进行预测。2、分别提取45对骨肉瘤及瘤旁正常组织标本,骨肉瘤细胞系和正常成骨细胞系的总RNA,逆转录成c DNA,利用实时荧光定量q PCR的方法,检测FENDRR的表达水平,用SPSS22.0软件包对45例骨肉瘤患者的临床病理资料及FENDRR表达水平进行统计分析。结果:1、利用生物信息学方法,对GSE17679数据集进行差异基因分析,发现FENDRR在肉瘤中异常低表达,聚类分析同样的结果,单独对FENDRR数据进行柱状图描述,发现FENDRR在肉瘤中比正常组织中显著低表达。2、FENDRR的表达在骨肉瘤组织中明显低于瘤旁正常组织（P<0.01）。3、FENDRR的表达在骨肉瘤细胞株SAOS2（P<0.05）、MG63（P<0.05）、MNNG/HOS Cl#5[R-1059-D]（MNNG-HOS）（P<0.01）、U2OS（P<0.05）、143B（P<0.01）中明显低于正常成骨细胞系h FOB1.19。4、结合临床病理资料,并根据45例骨肉瘤组织中的FENDRR的表达水平,对比瘤旁正常组织的相对是上调还是下调,分为高表达组和低表达组,结果显示:低表达组患者（n=32）对比高表达组患者（n=13）,有较进展的Enneking分期（P=0.042）和较高的转移率（P=0.008）,而跟其他的临床特征如性别（P=0.301）、年龄（P=0.528）、肿瘤部位（P=0.782）、肿瘤大小（P=0.102）没有明显的关联,进一步提示FENDRR低表达跟骨肉瘤的进展明显相关。结论:FENDRR在骨肉瘤组织及细胞株中表达下调,能够作为骨肉瘤进展判断的生物学标志。第二部分:FENDRR对骨肉瘤细胞生物学功能调控目的:探讨FENDRR对体外培养的骨肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭的影响和裸鼠体内尾静脉注射肺转移的调控。方法:1、体外:构建FENDRR的敲降si RNA干扰序列和过表达质粒pc DNA3.1-FENDRR,分别以乱序scrambled和空质粒pc DNA3.1作为对照组,骨肉瘤细胞株MNNGHOS和143B分别转染上述敲降序列和过表达载体,进行CCK8、克隆形成、划痕实验、transwell迁移、transwell侵袭等实验,检测敲降及过表达FENDRR后,对骨肉瘤细胞生物学功能的影响。2、体内:选用4-6周龄的NOD/SCID雄性免疫缺陷小鼠20只,分为实验组和对照组（每组10只）,通过尾静脉注射接种143B细胞,建立骨肉瘤肺转移模型。构建稳定转染过表达FENDRR或空载体的143B细胞株,分别进行注射,一周监测三次,是否发生了肺转移。8周以后,所有的小鼠脱颈椎处死,取出肺组织进行大体标本检查,进行石蜡包埋切片,统计肺转移结节数。结果:1、通过q RT-PCR进行检测MNNG-HOS和143B人骨肉瘤细胞株中的FENDRR敲降或者过表达能达到满意的效率。2、CCK8和克隆形成实验显示:骨肉瘤细胞株MNNG-HOS和143B中转染si RNA后,和阴性对照si-NC组比较,发现在细胞增殖活性方面没有明显的差异,转染过表达pc DNA-FENDRR和空载体对比,也是相一致的结果。3、细胞划痕实验发现:骨肉瘤细胞株MNNG-HOS和143B中转染si RNA后,和si-NC比,具有明显较快的划痕愈合率,而过表达pc DNA-FENDRR对比空载体,则表现为更慢的划痕愈合率。4、transwell实验表明:敲低FENDRR后,transwell小室结晶紫染色,发现骨肉瘤细胞具有更多的迁移和侵袭数量。相反,过表达FENDRR后,transwell小室结晶紫染色,发现骨肉瘤细胞迁移和侵袭的数量减少。5、裸鼠体内尾静脉注射肺转移实验表明:稳定转染FENDRR过表达组和转染空载体组相比,肺转移的结节数明显降低。结论:FENDRR跟骨肉瘤细胞增殖调控关系不密切,但是能明显抑制骨肉瘤迁移、侵袭和转移。第三部分:FENDRR对骨肉瘤细胞调控的分子机制目的:检测FENDRR对骨肉瘤细胞发挥调控所依赖的分子生物学机制。方法:1、对MNNG-HOS和143B骨肉瘤细胞分别进行细胞核细胞质分离,提取RNA,鉴定FENDRR在骨肉瘤中的亚细胞定位。2、RNA免疫共沉淀（RNA immunoprecipitation,RIP）验证在骨肉瘤细胞中FENDRR结合PRC2复合物的EZH2蛋白情况。3、用q RT-PCR实验检测MNNG-HOS和143B细胞转染si-EZH2后的转染效率。4、用pc DNA-FENDRR和si-EZH2共转染骨肉瘤细胞迁移能力,检测FENDRR对骨肉瘤细胞功能调控是否依赖EZH2。结果:1、FENDRR在骨肉瘤细胞核和浆中都有表达,主要定位于胞核内。2、RIP实验证实:FENDRR可以和EZH2蛋白结合,从而发挥表观遗传学调控作用。3、骨肉瘤细胞共转染pc DNA-FENDRR和si-EZH2后,可以挽救过表达FENDRR引起的迁移抑制能力。结论:FENDRR主要位于骨肉瘤细胞核内,FENDRR发挥对骨肉瘤细胞功能调控部分通过结合EZH2蛋白,并且FENDRR调控功能发挥需要EZH2的参与。第四部分:FENDRR下游靶基因探讨和检测目的:检测FENDRR发挥对骨肉瘤调控功能所依赖的下游靶基因。方法:1、在MNNG-HOS细胞中分别转染si RNA或者pc DNA-FENDRR过表达质粒,以si-NC和空载体作为阴性对照,提取细胞RNA,利用q RT-PCR技术检测预测的下游靶基因变化。过表达质粒,以si-NC和空载体作为阴性对照,提取细胞总蛋白进行western blot,对鉴定出的靶基因进行蛋白层面验证。3、提取人骨肉瘤组织中的GIT1 m RNA,并和FENDRR组织表达水平,采用pearson相关性分析进行两者的关联性探讨。结果:1、敲降或者过表达FENDRR后,调控细胞黏附和细胞外基质的相关分子表达改变,其中GIT1的表达变化最为显著（分别升高1.7倍或者下降了70%）。2、蛋白水平的证实了在敲降或者过表达FENDRR后,GIT1的蛋白表达变化跟RNA变化是一致的（分别升高1.4倍或者下降了60%）。3、表达水平spearson相关性分析表明在人骨肉瘤组织中,FENDRR表达和GIT1表达呈逆相关（R=-0.451,P=0.002）。结论:FENDRR抑制骨肉瘤迁移、侵袭和转移可能部分取决于下游靶基因GIT1的表达调节。2、在MNNG-HOS细胞和143B细胞中分别转染si RNA或者pc DNA-FENDRR全文总结:长链非编码RNA FENDRR在骨肉瘤组织及多个细胞株中低表达,其表达水平能明显区分肿瘤和瘤旁正常组织,FENDRR低表达的骨肉瘤患者处于肿瘤进展期,并且低表达状态跟肿瘤Enneking分期和转移密切相关。FENDRR跟骨肉瘤细胞的增殖活性没有统计学意义,但是明显抑制了肿瘤细胞的迁移、侵袭和转移能力。机制研究发现,FENDRR主要位于骨肉瘤细胞的细胞核中,通过和EZH2结合,发挥对骨肉瘤细胞的生物学调控,进一步研究发现,FENDRR主要调控细胞黏附和细胞外基质相关分子,其中GIT1是重要的下游靶基因。提示我们FENDRR表达变化可以作为骨肉瘤的诊断和预后分子标志,并为骨肉瘤的治疗提供靶向策略。