阳春砂是一种重要的南药之一,其药用成分以挥发油为主,包括α-蒎烯、β-蒎烯、莰烯、柠檬烯、香叶烯、芳樟醇、石竹烯、乙酸龙脑酯等挥发性萜类成分。植物体内挥发性萜类的合成主要由萜类合酶完成。萜类生物合成途径阶段I中合成萜类骨架的关键酶己比较清楚,但对挥发性萜类的合成起到直接环化和修饰作用的是阶段Ⅱ、Ⅲ的萜类合酶(即下游萜类合酶),现在关于下游萜类合酶的研究甚少。转录因子是指与靶基因的启动子或增强子结合,调控下游功能基因表达的一类结合蛋白。获得调控相关萜类合酶基因表达的关键转录因子能为有效地提高阳春砂挥发性萜类成分的含量提供研究靶点。1目的：转录因子具有“多点调控”的优势,作为上游的调控元件,既能调控植物激素信号转导的转录水平,又能调控萜类合成,应用基因工程改造转录因子从而定向调控次生代谢物积累具有良好的发展前景。然而,现有研究中有关转录因子的研究仍有诸多空白。因此,本论文拟深入分析茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate, MeJA)诱导阳春砂果实中参与茉莉酸(Jasmonate, JA)信号转导及萜类合成途径的相关转录因子基因,旨在全面认识阳春砂转录因子在萜类生物合成途径中的调控过程,为利用基因工程改造阳春砂,定向增加阳春砂挥发性萜类的产量奠定理论基础,促进中药种质生物化学的研究及基于转录因子的代谢工程研究。2方法：2.1阳春砂转录因子及其相关萜类合酶基因的挖掘利用MeJA诱导的阳春砂转录组及表达谱数据,以本地blast及注释方法筛选差异表达转录因子基因。再上呈所筛选的转录因子蛋白至NCBI CDD和Plant TFcat服务器进行转录因子保守结构域分析。结合转录组数据和生物信息学方法筛选共表达的转录因子及萜类合酶基因(unigene)。最后,结合转录组数据与次生代谢产物数据构建权重网络分析模型,挖掘出与萜类相关的转录因子及萜类合酶基因。2.2荧光定量PCR实验提取阳春砂果实的果皮及种子团部位的总RNA,并反转录成cDNA。根据候选基因(unigene)的序列设计引物并验证引物的有效性,筛选最佳退火温度。通过扩增效率、标准曲线相关系数和标准曲线对引物对进行评估,若有需要则重新设计引物。最后,应用实时荧光定量PCR测定候选基因的Cq值并以2-AACT计算其相对表达量。2.3高浓度茉莉酸甲酯喷施阳春砂将成熟期长势相近的果实的阳春砂植株随机分为溶剂组、MeJA喷施果实组,分别喷施含0.0001%吐温-80纯水的溶剂、600 μmol·L1 MeJA和1000 μmol·L-1MeJA于阳春砂果实中,同时设空白组(不作任何处理),喷施后24h采集。2.4 MeJA诱导的阳春砂果实内源茉莉酸含量的分析阳春砂样品粉末进行高效提取,减压浓缩后利用固相萃取进行富集,减压浓缩后以甲醇溶解,利用LC/MS测定样品中JA含量。2.5候选转录因子的生物信息分析以SubLoc、PSORT、TargetP预测转录因子的亚细胞定位和核定位信号肽。以拟南芥基因组作参考,利用planttfdb数据库查找目标转录因子相似度最佳的序列并搜索其对应的相互作用蛋白。使用JASPAR 2016 server预测转录因子与靶基因结合位点信息。最后,利用ORFfinder分析目标基因序列是否含有完整的开放阅读框。3结果：3.1 MeJA诱导差异表达的WRKY及相关萜类合酶基因的分析本论文利用MeJA诱导的阳春砂果实RNA-Seq数据筛选出36条包含WRKY保守域的转录因子。通过多种生物信息学分析,获得6个差异表达的WRKY基因(AvWRKY6, AvWRKY21、AvWRKY28、AvWRKY40、AvWRKY72和AvWRKY75),及其相关的4个萜类合酶候选基因((+)-新薄荷醇脱氢酶、S-(+)一芳樟醇合酶、(+)-大根香叶烯D合酶和月桂烯合酶基因)作为萜类合成相关的候选基因。对候选基因进行RT-qPCR验证并预测AvWRKY40、AvWRKY28和AvWRKY72可能协同调控(+)-新薄荷醇脱氢酶基因(AvNeoD)的表达,影响单萜类合成。3.2 MeJA诱导差异表达的MYC及相关萜类合酶基因的分析我们利用生物信息学方法筛选出5个与萜类合成相关的MYC基因(AvMYC4a、 AvMYC4b、AvMYC2a、AvMYC2b和AvMYC4c)和5个萜类合酶基因(β-桉叶醇合酶、倍半萜类合酶3、倍半萜类合酶A1、大根香叶烯D合酶和芳樟醇合酶基因)。利用生物信息学方法结合转录组及代谢产物数据获得与萜类合成相关的AvMYC4a、 AvMYC4b、AvMYC2b、β-桉叶醇合酶基因(AvEud)和大根香叶烯D合酶(AvGerD)基因。通过RT-qPCR数据构建调控模型,预测AvMYC4a,AvMYC4b可能没有直接调控AvEud基因,但AvMYC4a可能通过激活其他萜类合酶的启动子调控单萜类化合物合成。3.3 MeJA诱导对阳春砂内源JA及其信号转导基因的影响阳春砂果皮和种子团内源JA含量变化趋于一致。JA信号转导基因在转录水平存在空间差异性,且不同浓度MeJA响应效率也存在差异。200μmol·L-1MeJA更能诱导JA信号转导基因的表达。阳春砂与其他植物内JA信号转导转录方式具有同一性,但植物物种间局部基因具有多样性。根据JA信号转导基因调控网络推测MeJA可能诱导阳春砂果实内AvJARl表达,募集AvJAZ1b蛋白,AvJAZ1b与AvJAZ1a相互作用后释放出AvMYC2b,调控下游基因的表达。3.4高浓度MeJA诱导阳春砂候选基因的表达变化前期实验发现MeJA处理组挥发性萜类含量比溶剂组低,这可能由于溶剂浓度过高而致。600μmol·L-1 MeJA比200μmol·L-1 MeJA诱导挥发性萜类的效率更高,推测高浓度MeJA更能诱导挥发性萜类的合成。因此,以0.0001%吐温-80作为溶剂,600μmo1-L-1及1000μmol·L-1 MeJA处理阳春砂果实发现阳春砂果实内源JA均随着MeJA浓度升高而增加。阳春砂果皮及种子团内源含量变化一致。AvMYC2b及AvNeoD响应MeJA诱导,但两者对MeJA的敏感度有所差异。AvMYC2b的表达量变化与内源JA含量变化高度一致,AvMYC2b是JA信号转导途径中的核心元件,由此推测果实内源J.A的含量影响JA信号转导。基因共表达网络预测AvWRKY28与AvWRKY6协同调控AvNeoD的表达。AvMYC4a、AvMYC4b和AvWRKY72可能形成蛋白复合物进而激活AvEud的启动子调控相应的挥发性萜类合成。3.5萜类合成基因调控网络的初步构建及关键基因生物信息学分析脱氧木酮糖-5-磷酸(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate, MEP)和甲羟戊酸(Mevalonate,MVA)途径的关键萜类合酶基因的转录水平具有空间差异性,不同基因相应MeJA的浓度不一。从萜类合成关键基因的调控网络模型中可推测MeJA诱导阳春砂果实内JA信号转导,激发AvMYCs调控萜类合酶的表达,影响单萜类成分合成。AvWRKY6、 AvWRKY28、AvWRKY72、AvWRKY40可能主要调控单萜化合物的合成。AvWRKY75可能主要调控倍半萜类化合物的合成。AvWRKY40、AvWRKY72、AvWRKY28、AvWRKY6、 AvWRKY75和AvMYC2b可能均定位于细胞核中。除AvWRKY28和AvWRKY72外,上述候选转录因子均可能与其他因子互作。上述候选转录因子均没有完整全长,后续可根据上述信息设计实验进行功能验证。4结论：本论文以转录组数据结合代谢组数据获得了与5个萜类相关的转录因子(AvMYC2b、AvWRKY40、AvWRKY75、AvWRKY28、AvWRKY6)及3个萜类合酶基因,为利用基因工程技术改造阳春砂提供靶点。我们以RT-qPCR数据结合代谢产物数据构建了转录因子的相关调控模型,预测AvWRKY28、AvWRKY72、AvWRKY40和AvMYC2b可能主要调控单萜化合物的合成,AvWRKY75可能主要调控倍半萜的合成,为阳春砂挥发性萜类的转录因子调控研究提供了基础。