酸马奶中乳酸菌多样性及抗菌特性的研究

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酸马奶中乳酸菌的数量众多且种类复杂,其中含有许多具有优良工业性状的乳酸菌。因此,十分必要对这类菌种资源进行整理,以丰富我国的工业微生物资源,避免乳酸菌资源的损失和丢失。本研究首先对分离自内蒙古蓝旗地区的酸马奶样品中的乳酸菌进行鉴定,然后对该地区酸马奶中乳酸菌的多样性和生物学特性进行分析。以变形链球菌为指示菌,筛选能够抑制该菌生长的乳酸菌菌株,并对产生的抑菌物质进行了分离纯化和理化性质研究,为功能性乳酸菌的开发利用奠定了基础。本研究中从4份酸马奶中分离得到了29株乳酸菌,测定了这些乳酸菌的16S rRNA基因全长序列,并构建了乳酸菌属的系统发育树,根据亲缘关系对乳酸菌进行了鉴定,其中L.lactis(6株),L.plantarum(5株),E.faecium(5株),E.faecalis(4株),L.casei(2株),L.helveticus(2株),S.thermophilus(2株),L.delbrueckii subsp.bulgaricus(1株),Leu.mesenteroides(1株),Leu.garlicum(1株)。由此可以看出,酸马奶中主要含有Lactobacillus、Enterococcus、Lactococcus三个菌属,此外还含有少量的Leuconostoc、Streptococcus等。在种的水平上,L.plantarum(17.2%),E.faecium(17.2%),E.faecalis(13.8%)和L.lactis(20.7%)占到乳酸菌总数的2/3以上,是酸马奶中主要的乳酸菌;此外酸马奶中还含有少量的L.helveticus(6.9%),L.casei(6.9%),S.thermophilus(6.9%),L.delbrueckii subsp.bulgaricus(3.4%),Leu.mesenteroides(3.4%),Leu.garlicum(3.4%)。以变形链球菌为指示菌,从分离到的乳酸菌中筛选到一株抑制该菌生长的乳酸菌KLDS1.0432(L.helveticus)。采用NaOH中和法将KLDS1.0432发酵液的pH调到5.0后仍具有抑菌活性;使用胰蛋白酶和胃蛋白酶水解发酵液后,抑菌活性消失,证实了抑菌物质是蛋白质或者肽类物质。对KLDS1.0432菌株的生长曲线和对应的细菌素产量进行了测定,发现当菌株进入对数生长期后(6h),开始产生细菌素;稳定期(培养26h)产量达到高峰,随后产量不再增加。因此,该培养条件下,为获得大量的细菌素,发酵时间至少为26h。利用碱性条件下沉淀蛋白质,离心收集沉淀后复溶于HCl溶液的方法对发酵液中的蛋白质进行了分离;然后利用(?)KTA purifier 100系统,选择Hiload 16/60 Superdex 75 prep-grade凝胶色谱柱对细菌素进行分离纯化。结果发现,纯化后的细菌素的比活是原来的26倍。采用Tricine-SDS-PAGE电泳对细菌素的分子量进行了估测,结果发现细菌素的分子量在7823和14400Da之间。本研究初步探明了我国传统酸马奶中乳酸菌的组成,同时为16S rRNA基因序列分析技术在传统乳制品的微生物组成分析及乳酸菌的分类鉴定中的应用奠定了基础。同时,筛选到一株能够产生细菌素的乳酸菌菌株,为研究和开发具有自主知识产权、具有优良性状的工业用益生菌菌株提供了可能。
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