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研究背景:心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI）一般是由动脉粥样硬化斑块脱落或堆积引起冠状动脉部分或完全阻塞后,在一定时间又重新获得再通时加重的心肌及相关组织的损伤。其具体的发生机制尚不十分明确,但近年研究发现炎症反应在心肌缺血再灌注损伤中起了非常重要的作用。“内皮功能不全或功能紊乱”是包括缺血性心脏病等多种心血管病发生发展的病理基础,保护内皮细胞功能是防治心血管疾病的重要途径。牡荆素（vitexin,VT）是一种天然黄酮类药物,有较强的抗MIRI作用,可用于心绞痛、高脂血症等心血管疾病的治疗,但详细机制尚不清楚。迄今为止,尚未见有关VT对冠状动脉内皮细胞与心肌细胞相互作用的研究报道。因此,本课题通过建立细胞和动物的缺血缺氧及再灌注模型,拟观察血心脏管内皮细胞和心肌细胞中炎症相关因子变化和调控及其与心肌细胞焦亡之间的关系。第一部分:HIF-1α/iRHOM2信号在血管内皮细胞缺氧复氧所致炎症反应中的作用及介导小鼠心肌缺血再灌注后调控心肌细胞焦亡的分子机制目的:1.研究HIF-1α/iRHOM2信号在心脏血管内皮细胞缺氧复氧所致炎症反应中的作用。2.阐明心脏血管内皮细胞HIF-1α/iRHOM2信号介导小鼠心肌缺血再灌注后调控心肌细胞焦亡的分子机制。方法:通过生物信息学分析预测不同基因的差异表达以及蛋白之间的关系。用胶原酶消化法与时间梯度法分离原代小鼠CECs,建立原代CECs的H/R模型后,WB、RTPCR、免疫荧光法检测BAY、iRhom2-si RNA和IOX2等不同条件对H/R后CECs中HIF-1α、NFκB（P65）、iRhom2和TNF-α蛋白及m RNA表达的影响;co-IP检测H/R后CECs中iRhom2与NFκB（P65）和HIF-1α蛋白间的相互作用;ELISA检测不同处理对H/R后CECs上清液中TNF-α、IL-1α和IL-1β水平的变化;TUNEL和细胞流式法检测不同处理对H/R后CECs凋亡的影响;CCK-8法检测不同处理对H/R后CECs活力的影响;FITC-荧光渗透试验检测不同处理对H/R后CECs屏障功能的影响;WB法检测TNF-α受体抑制剂Infliximab（IN）对H/R后CECs中HIF-1α、iRhom2、TNF-α和iRhom2表达的影响;免疫荧光法检测IN对H/R后CECs中HIF-1α、NFκB（P65）、ADAM17和iRhom2蛋白表达及ADAM17和iRhom2蛋白相互作用的影响。使用传代法培养HCAEC和AC16细胞株建立共培养模型后,免疫荧光法检测TNF-α受体抑制剂IN对单独培养和与HCAECs共培养的AC16细胞H/R后GSDME-NT表达的影响;ELISA法检测IN对分别单独培养或共培养的HCAECs细胞和AC16细胞H/R后上清液中TNF-α、IL-1α、IL-1β含量的影响及iRhom2-si RNA转染对HCAECs细胞和AC16在H/R后细胞上清液中TNF-α含量的影响;电子显微镜观察共培养后AC16细胞形态及焦亡小孔形成的变化。通过左前降支结扎法手术建立C57小鼠心肌I/R损伤模型后,免疫组织化学法检测I/R小鼠心肌p-NFκB（P65）、活化的Caspase3和GSDME-NT的变化;WB法检测I/R小鼠心肌GSDME-NT、活化的Caspase-3和IL-1β蛋白表达的变化;超声心动图检测BAY对I/R小鼠心脏功能变化;ELISA法检测BAY对I/R小鼠LDH、NO、i NOS和ET-1的血清水平的影响;HE染色法检测I/R后小鼠心脏病理学改变;免疫组织化学法检测BAY及iRhom2敲低后对I/R小鼠心肌HIF-1α和iRhom2蛋白表达的影响;免疫荧光法检测BAY及iRhom2敲低后对I/R小鼠心肌IL-6、TNF-α和NFκB（P65）蛋白表达的影响。结果:1.基因表达综合（GEO）分析表明,在I/R模型中,内皮细胞HIF-1α、iRhom2和炎症相关因子的基因表达呈显著变化。2.在小鼠原代CECs模型中,WB、RT-PCR、免疫荧光法结果显示,与对照组相比,H/R组CECs细胞中TNF-α、NFκB（P65）m RNA和蛋白表达均上调,NFκB（P65）核转位显著增加,HIF-1α抑制剂BAY与iRhom2敲低均可显著逆转TNF-α、NFκB（P65）m RNA和蛋白表达上调,并抑制NFκB（P65）核转位;co-IP实验结果表明iRhom2未与HIF-1α聚合,但与NFκB（P65）有相互作用;CCk-8检测结果显示BAY和iRhom2-si RNA转染可显著增强H/R后CECs细胞活力,凋亡结果显示BAY或iRhom2-si RNA转染可显著抑制H/R后CECs细胞凋亡;荧光素内皮屏障实验与ELISA结果显示BAY或iRhom2-si RNA转染可增强H/R后CECs细胞屏障功能,并抑制H/R后CECs上清液中IL-1α、IL-1β和TNF-α水平;WB和免疫荧光结果显示,与对照组相比,IN可明显抑制H/R后CECs中NFκB（P65）、TNF-α、ADAM17和iRhom2蛋白表达;3.在AC16s和HCAECs共培养模型中,ELISA结果显示,与H/R对照组相比,IN可显著降低AC16s在H/R后上清液中TNF-α、IL-1α、IL-1β的水平;与HCAECs共培养的AC16s细胞在H/R后上清液中TNF-α、IL-1α、IL-1β水平进一步升高,IN可逆转共培养的AC16s炎症因子的水平增加。H/R的A16s细胞中释放的炎症因子水平显著低于HCAECs细胞;免疫荧光检测结果显示,与HCAECs共培养的AC16s在H/R后可进一步促进GSDME-NT的表达,IN同样可以逆转共培养的AC16s在H/R后GSDME-NT的表达上调;电子显微镜结果显示,H/R后心肌细胞焦亡小孔增多,细胞体积相对膨大圆润,与HCAECs共培养的心肌细胞除了焦亡小孔增多外,细胞还发生了炸裂现象,而IN可明显改善该现象。4.小鼠MIRI模型中,免疫组化结果显示,与假手术组相比,I/R组小鼠心肌细胞caspase3激活,GSDME-NT与NFκB（P65）表达增加;WB实验显示,与假手术组相比,I/R组小鼠心肌细胞cleaved-caspase-3、IL-1β和GSDME-NT表达显著增加;免疫组化实验结果显示,与I/R组相比,BAY可抑制I/R后小鼠心肌细胞HIF-1α和iRHOM2的上调;HE染色结果显示,BAY可改善I/R小鼠心肌细胞出现的明显的空泡化和炎性细胞轻度浸润;免疫荧光实验显示,BAY可抑制I/R小鼠心肌细胞IL-6、NFκB（P65）和TNF-α的蛋白表达;超声结果显示,iRhom2-sh RNA-AAV敲低后小鼠与I/R组比,小鼠心功能明显改善,LVEF和LVSF显著升高;免疫组化结果显示,小鼠心脏中iRhom2敲低后无法被I/R上调;且与I/R组相比,iRHOM2敲低后Cleaved-caspase3、p-NFκB和GSDME-NT的蛋白表达显著减少。结论:1.血管内皮细胞H/R后,HIF-1α/iRhom2信号通路激活,促进ADAM17成熟,导致致炎因子释放增加和炎症反应,并启动细胞焦亡的发生;2.小鼠心肌缺血再灌注后,CECs中的HIF-1α/iRHOM-2信号通路激活参与了I/R诱导的心肌细胞损伤,抑制HIF-1α/iRHOM-2信号可减少CECs释放致炎因子,减轻炎症反应,从而抑制心肌细胞焦亡的发生。第二部分牡荆素调控HIF-1α/iRHOM2通路保护血管内皮细胞H/R损伤及其介导小鼠MIRI后抑制心肌细胞焦亡的分子机制目的:1.明确牡荆素对H/R后血管内皮细胞的保护作用及抑制HIF-1α/iRHOM2通路对炎症反应的调控作用;2.探明牡荆素通过调节血管内皮细胞HIF-1α/iRHOM2信号参与小鼠心肌缺血再灌注后介导心肌细胞焦亡的分子机制。方法:使用传代法培养HCAEC细胞株后,建立HCAECs模型后,CCK-8法检测HCAECs最适缺氧时间,VT和BAY的抗H/R损伤的最适浓度;Elisa法检测VT对H/R后细胞上清液中的TNFα、IL-1α和IL-1β水平的影响;WB法检测VT对H/R后细胞iRhom2表达的的影响。使用胶原酶消化法与时间梯度法分离原代CECs后,建立原代CECs模型,使用流式细胞术检测不同浓度VT和iRhom2-si RNA对H/R后CECs凋亡的影响;免疫荧光法检测不同浓度VT和iRhom2-si RNA对H/R后细胞中iRhom2表达的影响;WB法检测不同浓度VT对H/R后细胞中iRhom2表达的影响及HIF-1α抑制、VT 10μmol/L和Rhom2-si RNA对H/R后细胞中iRhom2和HIF-1α表达的影响;q PCR法检测HIF-1α抑制、VT 10μmol/L和Rhom2-si RNA对H/R后细胞中iRhom2和ADAM17的m RNA表达水平的影响。使用胶原酶消化法与时间梯度法分离原代心肌细胞与CECs后,建立原代心肌细胞和CECs的H/R模型,观察不同处理后的CECs上清液对H/R的心肌细胞中NLRP3和IL-6蛋白表达的影响。通过左前降支结扎法手术建立小鼠心肌I/R损伤模型,H＆E染色法检测不同浓度VT对I/R手术后心肌细胞病理学变化的影响;进行心电图和超声心动图法检测,观察3、6和12 mg/kg VT对I/R小鼠的心电图和心功能的影响;Elisa法检测6和12 mg/kg VT对I/R引起的小鼠血浆中LDH、MDA和SOD水平变化的影响;免疫组化法检测3、6和12 mg/kg VT对I/R诱导心脏的NFκB（P65）、Caspase3和GSDM-E表达的影响。结果:1.在HCAECs模型中,Elisa结果显示10μmol/L VT可显著地降低H/R诱导的HCAECs上清液中的TNFα、IL-1α和IL-1β水平的增高;WB结果显示VT可抑制H/R诱导的HCAECs中iRhom2表达的增高;2.在CECs模型中,流式细胞术显示VT和iRhom2-si RNA显著地下调H/R诱导的CECs凋亡;免疫荧光结果显示VT和iRhom2-si RNA明显地降低H/R诱导的CECs中iRhom2荧光强度和蛋白质表达的增高;WB结果显示VT明显地降低H/R诱导的CECs中iRhom2蛋白质表达的增高;WB结果还显示表明HIF-1α抑制剂BAY除了可显著抑制H/R增加的HIF-1α表达外,还可明显地抑制H/R增加的iRhom2表达;VT 10μmol/L对H/R增加的HIF-1α和iRhom2表达也均有明显的抑制作用;q PCR结果显示VT 10μmol/L显著地抑制H/R增加的iRhom2和ADAM17的m RNA表达水平,HIF-1α抑制剂或iRhom2敲低后,H/R诱导的iRhom2和ADAM17的m RNA表达水平也显著降低;3.原代心肌细胞模型中,WB结果显示,H/R后的CECs上清液可进一步上调H/R后心肌细胞中NLRP3和IL-6的蛋白表达;4.小鼠MIRI模型中,H＆E染色结果显示,3、6和12 mg/kg VT对MIRI致心肌细胞排列、核染色等异常有明显的改善作用;心电图结果显示,与Sham组比较,I/R组小鼠心电图出现了明显的“J点”抬高;超声心动图检查表明VT可明显地改善I/R导致小鼠的左室射血分数（LVEF）和左心室收缩功能（LVSF）的降低;Elisa结果显示6和12 mg/kg VT可明显地改善I/R引起了小鼠血浆中LDH和MDA升高及SOD的降低;免疫组化结果显示3、6和12 mg/kg VT可明显地抑制MIRI诱导的心脏NFκB（P65）、Caspase3和GSDM-E表达的升高示。结论:1.血管内皮细胞H/R损伤后,HIF-1α/iRhom2信号通路上调,并促进ADAM17表达的增加;2.VT改善H/R诱导CECs的损伤并减少炎症因子的释放,该作用与抑制上调的HIF-1α/iRhom2信号通路和ADAM17表达增加有关;3.VT对小鼠MIRI的保护作用可能是通过减少心肌细胞焦亡和抑制上调的HIF-1α/iRhom2信号通路来产生的。