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研究背景研究背景系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）是一种慢性炎症自身免疫性疾病,好发于育龄期女性,男女发病比例约为1:9。尽管现有的研究揭示了人类狼疮的某些特征,但SLE的治疗方法仍旧落后于其他自身免疫性疾病。SLE具有高度复杂性和异质性,发病机制尚不完全清楚。长链非编码RNA（Long non-coding RNA,lncRNA）是指长度大于200个核苷酸的非编码RNA,可通过与DNA、RNA和蛋白质相互作用,在免疫细胞分化和激活中发挥重要作用。越来越多的证据表明lncRNA可在SLE中作为新的治疗靶点和疾病生物标志物。先前研究结果显示大量lncRNA在SLE中的表达存在异常,且与SLE的临床特征和疾病活动度相关。但目前关于lncRNA在SLE发生、发展中的研究仍然较为有限,lncRNA在SLE中异常表达的原因也不明了。启动子区DNA甲基化能够调控RNA的转录,进而参与多种疾病的发病过程,并且有望作为疾病诊断和预后的生物标记。然而,国内外对于启动子区甲基化调控lncRNA与SLE及其它自身免疫性疾病的研究鲜有报道。事实上,lncRNA启动子区甲基化与lncRNA表达相关,并参与疾病发病机制在其他疾病中已被报道。T淋巴细胞在细胞介导的免疫反应中发挥着核心作用,且在SLE患者的T细胞中已经观察到多种缺陷。因此,本研究推测:在SLE的T细胞中,lncRNA启动子区甲基化可能通过调控lncRNA表达参与SLE的疾病过程。本研究尝试找到受DNA甲基化修饰调控且与SLE发病密切相关的lncRNA,并研究其功能和作用机制。目的本研究目的在于利用人全转录组测序技术和850K-甲基化芯片技术建立SLE病例T细胞的lncRNA表达谱以及DNA甲基化图谱。综合分析筛选出与DNA甲基化修饰相关的lncRNA,在扩大样本人群实验中进行lncRNA表达水平的验证,并探讨差异表达的lncRNA与SLE病例临床特征的关联及各个lncRNA的受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve,ROC）。最后,对差异表达的与DNA甲基化修饰相关的候选lncRNA进行细胞功能验证,初步从lncRNA上游启动子区到下游编码基因角度揭示SLE疾病过程的相关机制,有望发现新的SLE特异性分子生物标志物和治疗靶点,并为SLE高危人群筛选和疾病防制提供重要科学依据。方法第一阶段:利用人全转录组测序技术和850K-甲基化芯片检测3对SLE新发病例和健康对照的T淋巴细胞的RNA和DNA,建立lncRNA表达谱和DNA甲基化图谱,初步筛选出可能与DNA甲基化修饰相关且表达异常的lncRNA。第二阶段:利用定量逆转录聚合酶链反应（quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR）在 101 例 SLE 病例和 117 例健康对照的 T细胞中对初筛中候选的8个lncRNA进行验证,同时分析上述8个lncRNA与SLE临床特征的关联。利用ROC曲线评估上述差异表达的lncRNA在SLE中的诊断价值。第三阶段:构建Jurkat（clone E6-1）细胞系,利用DNA甲基化抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷（5-Aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-dC）探索启动子区甲基化水平改变对lncRNA表达和T细胞功能的影响。第四阶段:在体外细胞功能实验中,借助慢病毒干扰载体和Jurkat（clone E6-1）细胞分别实现T细胞中MALAT-1和lnc-SERPINB9-1基因的稳定干扰。利用细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8,CCK-8）、流式细胞仪检测MALAT-1基因干扰对细胞增殖、凋亡和周期的影响。利用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测MALAT-1基因干扰对细胞因子分泌的影响。利用生物信息学分析技术与和双荧光素酶基因报告实验预测并验证MALAT-1、miR-2355-3p和SCIMP的相互作用机制。应用蛋白质免疫印迹法（western blotting,WB）探究MALAT-1基因干扰对SCIMP表达的影响。利用CCK-8和Annexin-V/PI双染法检测lnc-SERPINB9-1基因干扰对细胞增殖、凋亡的影响。结果本研究利用人全转录组测序技术发现在SLE病例组和健康对照组T细胞中有1486个差异表达的lncRNA,其中800个lncRNA在SLE病例T细胞中表达上调,686个lncRNA在SLE病例T细胞中表达下调。在SLE病例组和健康对照组的T细胞中,利用850K-甲基化芯片检测出1780个差异甲基化位点（Differentially methylated positions,DMP）,其中1460个DMP位点在SLE病例T细胞中低甲基化,320个DMP位点在SLE病例T细胞中呈现高甲基化状态。联合人全转录组测序和850K-甲基化芯片结果,筛选出8个可能与DNA甲基化修饰相关且表达异常的 lncRNA（lnc-EPSTI1-4,MIR4435-2HG,lnc-STYK1-2,lnc-SERPINB9-1,MALAT-1,TSPOAP1-AS1,ZMIZ1-AS1,lnc-ZNF138-2）进行 qRT-PCR 验证。101例SLE病例和117例健康对照T细胞的qRT-PCR结果显示,与对照相比,上述8个lncRNA在SLE病例T细胞的表达水平均有统计学差异（均有P＜0.05）。其中,lnc-EPSTI1-4,MIR4435-2HG,lnc-STYK1-2,lnc-SERPINB9-1,ZMIZ1-AS1（均有P＜0.05）在SLE病例组T细胞中表达上升;MALAT-1,TSPOAP1-AS1,lnc-ZNF138-2在SLE病例组T细胞中表达下降（均有P＜0.05）。进一步对上述lncRNA表达水平与SLE的临床特征进行分析发现,上述lncRNA与SLE的疾病活动度、临床表现、实验室指标和临床用药存在关联,提示这些lncRNA在SLE疾病过程的重要作用。利用Mann-Whitney U非参数检验分析lncRNA在SLE患者外周血T细胞中表达水平与临床用药的关联。结果显示,lnc-ZNF138-2表达水平在服用免疫抑制剂药物组和未服用免疫抑制剂药物组间有差异（Z=-2.119,P=0.034）,其他lncRNA表达未发现与临床用药之间存在统计学差异（P＞0.05）。应用ROC曲线分析SLE病例T细胞中上述lncRNA表达水平作为SLE诊断指标的有效性,发现lnc-STYK1-2和MALAT-1的曲线下面积达到0.70以上,具有一定诊断性。其中MALAT-1的曲线下面积最大,达到0.7886,灵敏度为66.34%,特异度为83.76%。DNA甲基化抑制剂5-Aza-dC干扰Jurkat（clone E6-1）细胞发现,与对照组细胞相比,5-Aza-dC 干扰组细胞的 lnc-EPSTI1-4、MALAT-1 和 lnc-SERPINB9-1 表达水平显著上升（均有P＜0.05）,且这三个lncRNA启动子区目标片段的甲基化水平下降,但差异无统计学意义。这说明lnc-EPSTI1-4、MALAT-1和lnc-SERPINB9-1表达可能受启动子区甲基化水平调控,但具体调控机制不清,值得进一步探索。除此之外,细胞功能实验结果表明5-Aza-dC可以抑制T细胞增殖,促进T细胞凋亡。体外细胞功能实验结果显示,与阴性对照组相比,MALAT-1基因干扰组在24 h,48 h和72 h细胞增殖能力均有显著提高（均有P＜0.05）;MALAT-1基因干扰组细胞凋亡比例下降（P＜0.05）;MALAT-1基因干扰组的G1期延长,G2期缩短（均有P＜0.05）,S期无显著差异（P＞0.05）;MALAT-1基因干扰组的IL-6、IL-17和TNF-α表达水平升高（P＜0.05）,IFN-γ表达水平降低;与阴性对照组相比,MALAT-1基因干扰组的miR-2355-3p表达水平显著上升（P＜0.05）,SCIMP表达水平显著下降（P＜0.05）。WB结果显示,与阴性对照组相比,MALAT-1基因干扰组的SCIMP蛋白表达水平下降,但两组之间的差异无统计学意义（P=0.061）。双荧光素酶基因报告实验结果提示,miR-2355-3p能够与MALAT-1以及SCIMP靶向结合。lnc-SERPINB9-1的细胞功能实验表明,与阴性对照组相比较,在24 h,48 h和72 h,lnc-SERPINB9-1基因干扰组的细胞增殖能力均显著降低（均有P＜0.001）;lnc-SERPINB9-1基因干扰组的细胞凋亡比例上升（P＜0.05）。结论（1）SLE患者的T细胞存在多个lncRNA表达异常,且狼疮T细胞存在广泛DNA 低甲基化。lnc-EPSTI1-4,MIR4435-2HG,lnc-STYK1-2,lnc-SERPINB9-1,ZMIZ1-AS1,MALAT-1,TSPOAP1-AS1 和 lnc-ZNF138-2 在 SLE 患者 T 细胞中表达异常。（2）甲基化抑制剂可升高Jurkat细胞中lnc-EPSTI1-4、MALAT-1和lnc-SERPINB9-1的表达水平,这三个lncRNA的表达可能与启动子区甲基化水平相关,但具体调控机制尚不清楚。lncRNA启动子区甲基化、lncRNA表达和SLE之间的关系值得深入研究。（3）MALAT-1基因干扰可促进T细胞增殖,抑制T细胞凋亡,影响T细胞周期,促进炎性因子IL-6、IL-17和TNF-α表达水平升高。MALAT-1可能通过吸附 miR-2355-3p 而作为内源性竞争 RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）调控SCIMP的表达。（4）lnc-SERPINB9-1基因干扰降低T细胞增殖,同时促进T细胞凋亡。