【摘 要】
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目的:葡萄糖调节蛋白78（Glucose-Regulated Protein 78,GRP78）在多种恶性肿瘤中表达明显升高,参与肿瘤的增殖、侵袭、迁移和耐药,且其表达量与患者预后相关。本文旨在研究GRP78蛋白对宫颈癌SiHa细胞生物学行为的影响及GRP78小干扰RNA联合紫杉醇处理对SiHa细胞药物敏感性的影响及作用机制。从而为临床诊治宫颈癌提供新的理论依据。方法:1.细胞培养:构建SiHa细
【基金项目】
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山西医科大学汾阳学院“肿瘤相关巨噬细胞对宫颈癌的作用及机制研究（编号:2019C08）”； 山西医科大学汾阳学院“自噬在TRAIL诱导宫颈癌细胞凋亡中作用的实验研究（编号:1142）”； 山西医科大学汾阳学院“临床分子诊断学重点实验室（编号:2020ZDSYS17）”；
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目的:葡萄糖调节蛋白78（Glucose-Regulated Protein 78,GRP78）在多种恶性肿瘤中表达明显升高,参与肿瘤的增殖、侵袭、迁移和耐药,且其表达量与患者预后相关。本文旨在研究GRP78蛋白对宫颈癌SiHa细胞生物学行为的影响及GRP78小干扰RNA联合紫杉醇处理对SiHa细胞药物敏感性的影响及作用机制。从而为临床诊治宫颈癌提供新的理论依据。方法:1.细胞培养:构建SiHa细胞体外培养模型。2.转染:将GRP78-siRNA用脂质体介导转染入SiHa细胞,确保转染成功,并选出沉默效率最高的siRNA。3.qRT-PCR:用于测定GRP78 mRNA、Caspase-1 mRNA、GSDMD mRNA及IL-1βmRNA的表达水平。4.Western Blot:用于检测GRP78、P-AKTser473、P-GSK3βser9、AKT、GSK3β、Cyclin D1、CDK4、CHOP、Bcl-2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Caspase-1、GSDMD以及IL-1β蛋白的表达。5.平板克隆形成实验:用于检测SiHa细胞的增殖能力。6.划痕实验、Transwell实验:用于检测SiHa细胞迁移和侵袭能力变化。7.流式细胞法:用于检测转染对SiHa细胞凋亡率的影响。8.MTT:用于检测紫杉醇对SiHa细胞的半数抑制浓度（IC50）。9.统计学方法:数据的分析统计用Graph Pad Prism（Version 5）软件。实验结果以±s表示,两组数据之间的比较采用独立样本t检验,P＜0.05即代表差异具有统计学意义。结果:1.转染不同位点siRNA对GRP78表达的影响转染GRP78-siRNA各组SiHa细胞中GRP78蛋白表达水平及GRP78 mRNA表达水平明显下降,且GRP78-siRNA1501干扰链的沉默效果最显著。2.沉默GRP78基因对SiHa细胞增殖的影响沉默GRP78基因导致SiHa细胞克隆数明显减少（P＜0.001）,为进一步明确其作用机制,检测了AKT和GSK3β的表达水平,结果发现,P-AKTser473和P-GSK3βser9的表达水平明显降低,而总AKT和总GSK3β基本无变化,此外,下游分子Cyclin D1、CDK4蛋白也是明显减少的（P＜0.001）。3.沉默GRP78基因对SiHa细胞迁移和侵袭的影响沉默GRP78基因导致SiHa细胞在12h、24h以及48h三个检测点迁移率均明显降低（P＜0.01）,Transwell实验表明SiHa细胞的穿膜数量明显降低（P＜0.001）,为了深入探究其中的作用机制,进一步检测了EMT相关蛋白的表达,结果表明,E-cadherin表达明显升高,N-cadherin和Vimentin表达明显降低（P＜0.001）。4.沉默GRP78基因对SiHa细胞凋亡的影响沉默GRP78基因导致CHOP蛋白明显增高,而Bcl-2蛋白明显减少（P＜0.01）;且SiHa细胞凋亡率明显升高（P＜0.001）。5.沉默GRP78基因联合紫杉醇处理对SiHa细胞药物敏感性的影响GRP78小干扰RNA联合紫杉醇处理后,基因水平结果显示,加入紫杉醇导致Caspase-1 mRNA、GSDMD mRNA及IL-1βmRNA表达水平均明显升高,当GRP78小干扰RNA与紫杉醇同时作用时,Caspase-1 mRNA、GSDMD mRNA及IL-1βmRNA表达水平升高更明显,差异有统计学意义（P＜0.001）;蛋白水平结果显示,Caspase-1、GSDMD、IL-1β蛋白表达水平总体趋势与基因水平相符合。结论:1.GRP78蛋白可以促进SiHa细胞的增殖,推测其可能通过激活AKT/GSK3β/Cyclin D1通路发挥作用。2.GRP78蛋白可以促进SiHa细胞的侵袭和迁移,该现象的发生可能与促进上皮间质转化进程有关。3.沉默GRP78基因可以明显增加SiHa细胞凋亡率及CHOP蛋白的表达。4.紫杉醇可以诱导SiHa细胞发生焦亡,降低GRP78蛋白的表达可以促进紫杉醇诱导的细胞焦亡进程,从而增加SiHa细胞对紫杉醇的敏感性。
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