【摘 要】
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大肠杆菌是一种典型的细菌性病原体,主要存在于人类和其他热血性动物的肠道中,可通过多种途径污染各种饮料和食品。尽管大多数种类大肠杆菌不会引起疾病,但有些可以产生肠毒
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大肠杆菌是一种典型的细菌性病原体,主要存在于人类和其他热血性动物的肠道中,可通过多种途径污染各种饮料和食品。尽管大多数种类大肠杆菌不会引起疾病,但有些可以产生肠毒素,是传染病暴发的主要原因,严重威胁到人们的身心健康和生命安全。研究表明,通过大肠杆菌基因序列分析间接实现大肠杆菌检测是一种可行的方法。因此,开发新型大肠杆菌基因序列检测技术进而实现大肠杆菌快速和准确监测具有重要的理论和实际意义。本论文基于目标物诱导信号探针转移(TISPS)的工作机制,依据捕获探针(CP)在金电极表面嫁接和不嫁接的区别,构建了两个结构相似的三探针信号增益型传感体系并用于大肠杆菌基因序列的检测,具体工作如下:一、传感器(S1)由捕获探针(CP1)和辅助探针(AP)通过杂交以长度为12碱基的CP1/AP双链状态存在,AP采用Au-S键自组装技术嫁接于金电极表面,信号探针(SP)游离于溶液体系中。加入目标DNA序列之前,SP上指示剂亚甲基蓝(MB)标记物远离金电极表面,电子传递效率很低,背景电流信号小;加入目标DNA之后,目标DNA取代AP与CP1杂交形成更稳定的24碱基的长CP1/目标DNA双链游离于溶液体系中并将AP释放,呈现出杂交阻力减小(HRD)的作用模式。释放后的AP可与溶液中游离的SP形成8碱基的短AP/SP双链并将MB标记物拉近至电极表面,电子传递效率增大,产生大的检测电流,从而实现增益的电流变化。实验优化了 CP1和AP比例、电极表面探针密度、SP浓度和杂交温度等影响传感器信号增益的主要构建参数和检测条件。采用电化学交流伏安(ACV)和循环伏安(CV)技术对传感器结构进行了表征,并从多个方面对传感器综合性能进行评价。该传感器用于目标DNA序列检测,线性范围为0.01 PM～1 nM,线性方程和相关系数(R2)分别为y=31.203x+441.34和0.9787,检测限为～7 fM;用于单和两个点突变识别分析,其在纯工作介质中的识别因子Fs1和Fs2分别为1.29-±0.2和2.95±0.4;对其在实际样品中的工作性能进行了考察,结果显示在50%自来水、50%纯净水、50%牛奶和浓度为50%及100%小牛血清中均表现出较强的抗污染能力。二、在S1结构上进行适当变化,将CP2也采用Au-S键自组装技术与AP一起共嫁接于金电极表面构建了第二个传感器(S2)。结构上的变化导致了该传感器呈现出与S1完全相反的杂交阻力增加(HRI)的作用模式进而引起传感行为和综合性能的变化。该传感器用于目标DNA序列检测,线性范围为0.01 pM～0.5 nM,线性方程和相关系数(R2)分别为y=45.563x+55.5和0.9753,检测限为～10 fM;用于单和两个点突变识别分析,其在纯工作介质中的识别因子Fs1和Fs2分别为1.52±0.2和3.90±0.5,同时表现出独有的特异性可调能力;对其在实际样品中的传感效果进行考察也获得了较好的工作性能。
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