目的：建立一种针对人外周血妊娠相关血浆蛋白A (pregnancy-associated plasma protein A, PAPP-A)的生物素-亲和素酶联免疫学检测(enzyme-linked immunosorbnent assay,ELISA)方法,并运用此方法对临床上相关疾病的PAPP-A水平进行检测,了解其临床应用价值,指导相关疾病的诊断和治疗。方法：1. PAPP-A蛋白纯：采集足够量妊娠足月孕妇混合血清,经透析后,根据PAPP-A的分子结构和理化特性,选择两种经济高效的层析介质：Sephadex G-200凝胶、阴离子交换剂,经SDS-PAGE凝胶电泳及免疫印迹进行蛋白鉴定。2.抗体标记及纯化：(1)改良过碘酸钠法HRP标记抗PAPP-A mAb-10E1,酶结合物经分子筛凝胶过滤层析进行纯化。(2)生物素标记抗PAPP-A mAb-10E2,用透析的方法去除游离的生物素,达到纯化的目的。3.方法学建立及反应条件优化：将微孔板包被生物素化牛血清白蛋白(BBC)、及链霉亲和素,与生物素化的抗PAPP-A mAb反应,建立间接包被酶联免疫检测法。用棋盘滴定法对微孔板最佳包被浓度、抗体最优工作浓度及反应时间、温度等条件进行优化。4.方法学评价：进行灵敏性、重复性、准确度、稳定性等参数评价,并与国外同类PAPP-A检测试剂盒进行相关性比较。5.初步临床应用：(1)妊娠早期(8-14周)孕妇血清中PAPP-A含量测定,分析其含量与孕妇年龄、体重、孕周的关系；(2)急性冠脉综合症(ACS)患者血清中PAPP-A含量测定,分析其疾病相关性,并以正常人血清作为阴性对照。结果：1. PAPP-A蛋白纯化：我们建立了一整套简单、经济、适用的PAPP-A层析工艺,获得较高纯度的PAPP-A蛋白。SDS-PAGE凝胶电泳图中只见一条分子量约为200kD的清晰蛋白质条带,免疫印迹显示主要纯化产物即为PAPP-A。2.抗体标记：酶结合物经Sephadex G-200分子筛凝胶过滤层析后,收集的第一峰即为标记HRP的抗PAPP-A mAb,即酶标抗体。测定酶结合物的量：0.9g/L,抗体为0.31g/L。3.方法学建立及反应条件优化：(1)棋盘滴定结果显示,生物素化牛血清白蛋白最佳包被浓度1:3000 (3.33μg/ml),链霉亲和素包被浓度1:4000 (3.0μg/ml)。(2)生物素化抗体及酶标抗体最佳工作浓度均为1：4000。(3)系列标准品为纯化PAPP-A抗原稀释所得,浓度分别为：0,1,2.5,5,10,25,50μg/ml,本试剂盒的检测范围为0.31～50μg/ml。(4)最适反应温度为37℃,时间为30min。4.方法学评价：本文所建立的方法灵敏性为0.31μg/ml,回收率均在95%-100%之间；线性、稳定性及特异性良好；批内变异系数(CV)均不大于10%,批间CV均不大于15%；与国外同类方法进行相关性分析,r=0.982,提示两种检测方法高度相关。5.初步临床应用：(1)以160例正常妊娠早期孕妇(8-14周)为研究对象,筛查唐氏综合征,结果发现：正常妊娠孕妇不同孕周血清PAPP-A浓度中位数水平随着孕周的增加而增加,这与文献报道一致；此外,我们还发现：高龄孕妇(≥35岁)血清PAPP-A浓度明显比低龄孕妇的低；随着孕妇体重指数的增加,血清PAPP-A浓度相对降低,而且这种降低是呈直线相关的。(2)50例ACS患者血清,经测定分析,结果显示,我们的方法灵敏度不够,需进一步研究提高灵敏度。结论：1.建立了一整套简单、经济、适用的PAPP-A层析工艺,获得较高纯度的PAPP-A抗原,为建立PAPP-A ELISA测定方法奠定了基础。2.间接包被微孔板建立的PAPP-A ELISA测定法,灵敏度高,稳定性及特异性良好,与国外用类试剂盒相关性较高。3.PAPP-A测定对唐氏综合征筛查具有重要意义,对ACS有待进一步研究,以提高灵敏度。