三种中药材病毒病原鉴定及MVCV蜀葵株系侵染性克隆的初步构建

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近年来,随着国家对中药材体系的重视和扶持,各地中药材种植规模不断扩大,但病毒病随之而来,中药材产量和质量每况愈下,严重制约了中药材的人工栽培和经济效益。目前对中药植株病毒病的研究相对薄弱,因此及时发现并明确患病植株的病毒病原及进化来源意义重大。本研究对浙江桐乡的杭白菊、山西境内的洋金花、板蓝根病毒病病原进行鉴定,并初步构建MVCV蜀葵株系侵染性克隆,得到实验结果如下:(1)表现典型黄化、矮化症状的杭白菊被菊花B病毒(Chrysanthemum virus B,CVB)和菊花R病毒(Chrysanthemum virus R,CVR)复合侵染。对CVR杭白菊分离物(CVR-TX)的全基因组进行扩增,得到CVR-TX基因组全长为8872 nt,具有香石竹潜隐病毒属成员的结构特征,包含6个开放阅读框(Open reading frame,ORF),编码6个多聚蛋白。基于基因组全长、复制酶和CP蛋白进行相似性分析并构建系统进化树,结果显示CVR-TX与香石竹潜隐病毒属成员亲缘关系较远,与CVR-BJ亲缘关系最近。(2)表现典型黄化、皱缩症状的洋金花被蚕豆萎蔫病毒2号(Broad bean wilt virus2,BBWV2)所侵染,这是BBWV2侵染洋金花的首次报道。对BBWV2洋金花分离物(BBWV2-DF)的全基因组进行克隆,得到BBWV2-DF RNA1的基因组全长为5985nt,RNA2基因组全长为3600nt。进一步对BBWV2-DF与其他来源的BBWV2进行序列相似性分析,结果显示BBWV2-DF的RNA1与来自白术的BBWV2分离物相似性较高,RNA2与来自平卧菊三七的BBWV2分离物相似性较高。氨基酸系统进化树显示BBWV2-DF的RNA1和RNA2均与BBWV2-SN聚为一簇,亲缘关系最近。(3)表现典型黄化、斑驳症状的板蓝根被芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)和BBWV2所侵染。其中TuMV侵染板蓝根为首次报道。对TuMV板蓝根分离物(TuMV-BLG)全长进行扩增,得到TuMV-BLG全长9833nt,具有一个ORF,编码一个由3166个氨基酸构成的多聚蛋白,切割后得到:Pl、HC-Pro、P3、P3N-PIPO、6KI、CI、6K2、VPg、NIa、NIb和CP,酶切位点具体为Y/S、G/G、Q/A、Q/T、Q/N、E/A、E/S、Y/A、Q/A。通过对比发现TuMV-BLG与其它来源的TuMV相似度高,但亲缘关系较远,其中与来自日本的萝卜分离物JPN1亲缘关系最远。(4)利用Gibson组装技术连接MVCV和p Green II-35S穿梭质粒,初步构建MVCV蜀葵株系侵染性克隆。通过MVCV侵染性克隆的构建可有效避免其对大肠杆菌的毒害作用,便于MVCV致病机理、防治策略以及蜀葵病毒病等研究的顺利开展。
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