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聚酮类化合物(polyketide, PK)和非核糖体多肽(nonribosomal peptide, NRP)是两类重要的次级代谢产物,在农业、医药、环境保护等领域有重要的应用。面对日益严重的细菌耐药性问题、新疾病危害和环境污染,寻找具有新结构、新生物活性的化合物成为人们关注的热点。理论研究表明,自然界尚有大量未发现的PK和NRP。然而,由于受已发现化合物的干扰,运用传统的化合物分离手段分离获得新化合物的几率降低。高通量筛选或其他效率更高的化合物筛选方法受到国内外学者的青睐。本研究采用PCR扩增和基因组测序的方法,获得菌株Paenibacillus tianmuensis F6-B70、Paenibacillus elgii B69的编码PK和NRP生物合成的PKS基因和NRPS基因片段。经序列分析,预测P.tianmuensis F6-B70、P. elgii B69具有产新化合物的能力,并成功分离到新抗生素paenimacrolidin (PAM)和新嗜铁素paenibactin。在此基础上,研究了PAM和paenibactin的生物活性,并对paenibactin生物合成基因簇的功能、进化及导致基因簇产物多样性的机制进行了探讨。主要研究成果如下：1、基于PKS、NRPS基因的抗生素PAM研究以P. tianmuensis F6-B70基因组为模板进行PCR扩增,获得NRPS、PKS基因片段各四条。经序列分析,推测P. tianmuensis F6-B70具有产新化合物的能力。对P. tianmuensis F6-B70的菌体抽提液进行分离纯化,获得抗生素PAM. PAM是首个从Paenibacillus属中分离到的PK,分子量为542Da,分子式为C33H5006。 PAM能抑制包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐氨苄西林表皮葡萄球菌在内的葡萄球菌。MIC (Minimum inhibitory concentration)值为16-32μg/mL。 PAM在37℃不稳定,其MIC值随孵育时间延长而快速升高。PAM抑菌而非杀菌的作用机理及不稳定的特性影响了PAM的抗菌活性。2、基于NRPS基因的嗜铁素paenibactin的分离、纯化及鉴定分析P. elgii B69基因组,获得NRPS基因簇pae。该基因簇由paeGACEBF6个基因组成。经序列分析,预测pae基因簇参与一种新嗜铁素的合成,该嗜铁素由DHB (2,3-dihydroxybenzoate)、Tir、Gly的类似物组成。选用缺铁培养基诱导P. elgii B69产嗜铁素。分析发酵液,发现嗜铁素paenibactin。经MS、NMR测定,paenibactin分子式为C42H48N6O18,是由三个(DHB-Ala-Thr)单元通过酯键连接而形成的三聚物。Paenibactin是首个从Paenibacillus属中分离并完成结构鉴定的嗜铁素,其螯合Fe3+的比例为1：1。3、Paenibactin的生物合成基因簇采用PCR技术扩增paeF-A1片段,将之整合入表达载体pET-28a,再转化Escherichia coli BL21(DE3)进行异源表达。体外生化实验表明：结构域PaeF-A1的特异性底物为Ala, pae基因簇即为paenibactin的生物合成基因簇。在此基础上,探讨了paenibactin的生物合成途径、paenibactin-Fe3+转运机制及被螯合Fe3+的释放机制。4、Paenibactin生物合成基因簇的系统发生通过构建系统进化树,证明pae基因簇是由bacillibactin的生物合成基因簇dhb进化而来,类芽孢杆菌是通过横向基因转移的方式获得pae基因簇的祖先。突变可能是导致dhb基因簇产物多样化的原因。