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固态发酵是中国白酒酿造的特色,属于边糖化、边发酵的双边发酵模式。固态发酵除了涉及数量巨大、种类繁多的微生物和生物酶外,还涉及酶、微生物与底物之间复杂的相互作用关系。在众多种属的微生物中,曲霉对白酒酿造起着非常重要的作用,它不仅为固态发酵的顺利进行提供多种功能性生物酶,如糖化酶、淀粉酶、蛋白酶等,以促进底物大分子的降解和其他功能性微生物的生长,它还在乙醇和众多风味物质的形成与积累中起着不可替代的作用。固态法白酒酿造特有的酸性环境,造就了独特曲霉菌株的生长及其功能酶作用的发挥。因此,开展中国白酒固态发酵过程中功能性曲霉资源的筛选工作,并研究它对发酵过程的影响,对于深化人们对双边发酵机理的认识,促进固态发酵技术的升级都具有非常重要的意义。本课题以酱香型白酒特殊的酿造条件为背景,以曲霉为主要微生物研究类群,从发酵酒醅和大曲中筛选对双边发酵有特殊功能和作用的微生物。通过实验,获得了一株高产糖化酶和蛋白酶的功能曲霉。在此后的固态发酵过程中,分析了该菌株及其所产糖化酶和蛋白酶对主要酿造工艺胁迫条件的耐受性;考察了发酵状态对菌株产酶的影响;对比研究了菌株在固液两种状态下的胞外蛋白组差异情况;利用纯酶强化发酵实验,探究了纯酶对白酒风味形成的影响机制。论文所取得的主要结论如下:(1)结合白酒酿造的特点,以高产功能酶为目标,对产酶微生物进行了筛选,共得到103株,分属于10个种的曲霉属菌株:Aspergillus niger、A. oryzae、A. terreus、A.tubingensis、A. flavus、A. hennebergii、A. fumigatus、A. niveus、A. candidus和Monascussp.。其中,A. hennebergii为固态发酵过程中的主要产酶菌株。该菌株可同时高产糖化酶和蛋白酶,分别达2173.51U/g发酵醅和368.59U/g发酵醅。该菌还具有较高的环境胁迫耐受力,可以在pH2.5、温度50℃和乙醇浓度8%(v/w)的环境中良好生长,显示其优良的发酵性能。(2)应用二维凝胶电泳(2-DE)结合质谱(MALDI-TOF MS/MS)技术对菌株在固、液两种状态下生长时的胞外蛋白组进行了比较研究。所有鉴定的蛋白点中有147个与黑曲霉、米曲霉等7种曲霉分泌的蛋白具有高度同源性,而47个差异蛋白点,涉及30种不同蛋白。这些结果表明固态发酵不但有助于菌株高产糖化酶和蛋白酶,还有助于菌株分泌其他酶类,促进发酵的顺利进行和风味物质的形成。(3)根据蛋白组学研究的结果,本研究进一步对菌株所产的酸性蛋白酶进行了纯化与表征。通过硫酸铵盐沉淀、阴离子交换柱和凝胶柱分离和纯化得酸性蛋白酶组分AP2和AP3。质谱鉴定其分别与2-DE图上的蛋白点15和273对应,AP2与A.niger BCRC32720分泌酸性蛋白酶具有高度同源性,AP3鉴定为未知蛋白。动力学参数结果表明AP2和AP3对麦类蛋白的催化水解能力较强,且AP3优于AP2。AP2和AP3具有明显的酸性特征,其最适pH及pH稳定性分别为4.5和4.0,pH4.0~6.5和pH2.8~6.0;而且AP3在30~60℃体现了优良的热稳定性特性;AP3对乙醇的耐受浓度大于10%(vol)。这些结果表明该菌株的胞外酸性蛋白酶不但具有耐酸、耐温、耐乙醇特征,还具有对麦类、豆类蛋白较强的水解特性。这也进一步表明了其在麦类、豆类食品生产中的重要作用。(4)结合实际生产应用,实验考察了AP3酶在固态发酵中的作用情况。结果表明,AP3的添加可明显提高产品风味物质的含量。GC-MS分析结果显示出添加AP3的酒醅中风味物质含量较对照提高了183.94%,醇类、酸类、酯类和芳香族化合物的含量增加显著,其中苯乙醇由425.9μg/kg酒醅提升到1698.7μg/kg酒醅,乙酸乙酯由628.8μg/kg酒醅提升到1580.1μg/kg酒醅。同时,蛋白水解度、氨基酸态氮等分析结果进一步验证了此酶对风味的调节机制。通过添加AP3,小麦蛋白水解度提高了28.26%,氨基酸态氮含量提高了34.21%,S.cerevisiae生物量提高了37.09%,总酸提高了36.17%,发酵醅中乙醇含量提高了38.29%。这些结果表明AP3的添加促进了蛋白的水解,提升了发酵体系中氨基酸态氮、总酸、乙醇等的含量。本研究的结果表明A. hennebergii为固态发酵中的一株性能优良的曲霉。该菌株不仅具有高产糖化酶、蛋白酶和多种风味酶类的特征,还具有促进、调节糖化、发酵和生香进程的作用。本研究的结果不仅丰富了中国白酒固态发酵的基础理论和应用实践,还为传统白酒酿造的现代化技术提升提供了生物资源。