论文部分内容阅读
白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)属于线头病毒科(Nimaviridae)的白斑病毒属(Whispovirus),具有很强的传染性,是危害虾蟹等甲壳类最严重的水产病原之一。2015年有学者首次报道池塘养殖的中华绒螯蟹感染WSSV,造成很高的死亡率。虽然对WSSV的致病机理进行了探索,但至今仍无有效的防治方法。有研究表明自噬在病毒与宿主相互作用中起关键作用,本文围绕WSSV感染不同宿主之后的组织和解剖症状,感染中华绒螯蟹后肝胰腺、鳃和肠道部位的组织病理变化,利用Western-blot和免疫荧光技术检测WSSV诱导中华绒螯蟹血细胞自噬,研究了WSSV诱导血细胞自噬体形成以及可能的激活机制。取得如下研究结果:从自然发病的克氏原螯虾和凡纳滨对虾体内分别分离到WSSV和维氏气单胞菌AVZ01。将提取的WSSV病毒液重新注射健康克氏原螯虾后出现相同症状并且扩增出目的条带。AVZ01进行人工回归感染试验后,对虾发病症状与自然发病症状相似,凡纳滨对虾的LD50为8.7×105 CFU/mL。根据该菌株的形态特征、生化特性、16S rRNA基因序列分析,综合判断该病原菌为维氏气单胞菌。提取的WSSV病毒液注射斑马鱼后未观察到异常症状。中华绒螯蟹感染WSSV 1-2天无明显症状,3-7天出现反应迟钝,摄食率低,触碰无躲避及攻击行为;附肢无力,人工倒置中华绒螯蟹后很难迅速恢复。解剖发现背壳易分离,血淋巴不易凝固,鳃丝肿大颜色较暗,肝胰腺淡黄色。在WSSV感染的72 h后,组织病理结果显示,肝胰腺中,基膜与肝胰腺细胞完全脱离,空隙增大,空泡开始破裂,部分肝细胞解体散落管腔中,肝小管仅可见模糊的轮廓,肝胰腺外观呈灰白色浆糊状;鳃叶角质层与上皮细胞出现空隙,并且角质层出现褶皱,鳃腔中形成黑色肉芽肿,鳃腔出现肿胀,有些区域是正常鳃叶厚度的2-3倍,部分细胞核从褶皱破裂处溢出,鳃组织肿胀,柱状上皮细胞脱落,细胞核肿大;肠道部分肠绒毛坏死脱落,与肠上皮形成空隙。随着感染时间增长,肠绒毛完全变形脱落,肠绒毛溶解,细胞核脱落变形并穿过肠上皮,肠道管腔模糊并且出现碎片等杂质。自噬在免疫系统中发挥重要作用,它可以感知病毒,具有抗病毒效应。本研究使用自噬激活剂雷帕霉素(Rapamycin)处理中华绒螯蟹血细胞24 h后观察到胞质型微管相关蛋白(microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3,LC3)中LC3-Ⅰ酯化成LC3-Ⅱ以及自噬斑的形成,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)处理24 h,血淋巴细胞LC3-Ⅱ转化率明显高于磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)处理组。体内注射WSSV也能诱导血细胞LC3-Ⅱ和自噬斑形成,WSSV诱导的自噬在0-72h内呈现先升高后降低,再升高又降低的过程,即在0-12 h先升高,12-24h后降低;24-48 h再升高,48-72 h又降低。雷帕霉素激活的自噬在0-72h内呈现先升高后降低的过程,即在0-24 h先升高,24-72 h后降低。通过RT-PCR分析显示,在WSSV感染中华绒螯蟹血细胞中两种参与自噬形成的基因(EsGabarap和EsAtg7),在12-24 h表达量显著升高。综上所述,本文通过对WSSV感染中华绒螯蟹后组织病理变化,以及WSSV诱导中华绒螯蟹血细胞自噬和自噬相关基因的表达变化进行研究,为了解病毒感染后造成的组织病理损伤以及病毒和血淋巴自噬之间作用机制提供了重要的理论基础,为今后WSSV的有效防治提供了新的参考依据。