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研究背景：川崎病(Kawasaki disease),是一种自限性全身血管炎性综合征,为5岁以下婴幼儿的急性发热出疹性疾病,属于自身免疫炎症性疾病。由日本儿科医师Tomisaku Kawasaki在1967年首先报道,开始以为是罕见疾病,但目前川崎病已取代风湿热成为许多国家(亚裔国家多见)婴幼儿和儿童获得性心脏病的首要病因,也是我国常见的成人心血管疾病的病因之一。病程中内皮细胞坏死、脱落可以导致血管内膜受损、平滑肌层和胶原暴露、血小板凝聚,上述病理过程进而加重了炎症反应,使血管壁结构完整性被破坏,最终致冠脉狭窄或阻塞,甚至冠状动脉瘤。内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells, EPCs)是血管内皮细胞的前体细胞,能够在内源性或(和)外源性刺激因素作用下促进内皮修复和血管新生,能够维持血管内皮完整性,从而维持血流动力学的稳定。组织缺血缺氧或内皮损伤时,骨髓EPCs被动员至外周血,通过增殖、迁移、归巢、分化整合至内皮缺损部位,参与血管损伤的修复以及微血管生成过程。促进EPCs的增殖、动员及分化,增加外周血循环EPCs的数量,将是冠状动脉损伤治疗的新方向。而目前关于内皮祖细胞的定义,生物学特性,动员、迁移、归巢及分化的具体过程及详细机制都不甚清楚或者存在很大争议。Notch4信号介导的细胞间通讯在心血管发育及修复过程中有重要作用,Notch4信号通路是维持造血干细胞以及EPCs等细胞未分化状态的关键。EPCs表面存在Notch4受体,与相应配体结合后能够促进EPCs增殖、分化及动静脉转化等过程,在血管生成与修复中起重要调控作用,因此Notch4信号在EPCs生物活性调控和增殖、分化成熟中起到关键作用。鉴于川崎病病因及发病机制仍不明确,而川崎病患几EPCs状态的临床研究有限,且受到细胞间相互作用、药物干预及伦理学等多方面问题的制约,我们无法深入研究EPCs的真实状态。因此,本研究通过干酪乳杆菌细胞壁萃取物(LCWE)免疫刺激构建小鼠川崎病冠状动脉病变模型,检测小鼠骨髓EPCs含量及otch4的表达,同时进行体外培养,研究川崎病冠状动脉损伤时,EPCs的含量、Notch4的表达及EPCs功能的改变,以及在mRNA和蛋白水平上Notch4及其下游信号RBP-Jκ的表达变化。目的：通过LCWE诱导川崎病冠脉损伤的小鼠模型,在其不同病程阶段探究骨髓EPCs含量、Notch4的表达和EPCs功能的改变及Notch4-RBP-Jκ信号通路在川崎病冠脉损伤及修复中的作用。方法：第一部分：小鼠骨髓EPCs的培养及功能检测与鉴定1.用干酪乳杆菌制备干酪乳杆菌细胞壁萃取物(LCWE)。2. BALB/C品系雄性小鼠,通过单次腹腔注射LCWE,建立小鼠川崎病冠状动脉损伤模型。3.用密度梯度离心法获取小鼠骨髓单个核细胞,用EGM-2培养7天后进行相关检测。4.细胞增殖活力检测：用CCK试剂盒检测细胞增殖活力,用酶标仪测定在450nm处的吸光度,并计算其活力。5.细胞粘附能力检测：用胰酶消化细胞,并重新接种于24孔板内,置于培养箱内培养30min后,PBS冲洗后显微镜下计数贴壁细胞。6.细胞迁移能力检测：用插入式Transwell24孔板检测细胞迁移能力,在显微镜下进行细胞计数。7.体外血管形成能力：将EPCs接种于ECMatrix胶上,置于培养箱内培养,并于4、6、8、10、12h在显微镜下观察小(血)管生成情况。8.免疫荧光(1)免疫双荧光鉴定：用DiI-acLDL和FITC-UEA-I孵育细胞,用DAPI染核,于激光共聚焦显微镜下观察。(2) RBP-Jκ和VEGFR-2免疫荧光检测：分别用RBP-Jκ和VEGFR-2抗体孵育细胞,用DAPI染核,于激光共聚焦显微镜下观察。第二部分：检测川崎病不同病程阶段小鼠骨髓EPCs含量和Notch4的表达1.分别取LCWE腹腔注射后3d,7d,14d,28d的小鼠及对等时间的对照组小鼠,分离出骨髓单个核细胞,用CD34-eFluro660, Notch4-PE, Flk-1-FITC, CD45-Percp-cy5.5标记细胞,用流式细胞术检测EPCs和Notch4(+)EPC的含量。2.体外培养小鼠骨髓EPCs7天后,用胰酶消化细胞,制备细胞悬液,同样用流式细胞术检测EPCs和Notch4(+) EPC的含量。第三部分：荧光定量PCR检测NOTCH4. RBP-Jκ信号通路、及内皮相关因子P-Selectin. VCAM-1的mRNA的表达定量PCR检测体外培养的小鼠骨髓EPCs的NOTCH4、RBP-Jκ、P-Selectin、 VCAM-1在mRNA水平的表达。第四部分：Western Blot检测体外培养的小鼠骨髓EPCs的RBP-Jκ、 VEGFR-2蛋白的表达提取体外培养的小鼠骨髓EPCs的总蛋白,经过SDS-PAGE电泳,转膜,封闭,孵育一抗、二抗,加化学发光底物显色,显影等步骤,获得蛋白表达的影像,扫描并分析蛋白条带灰度值。结果：第一部分：体外培养的小鼠骨髓EPCs的功能检测与鉴定1.体外培养的川崎病小鼠模型骨髓EPCs集落形成能力显著降低。2.体外培养的川崎病小鼠模型骨髓EPCs的增殖活力明显低于对照组。3.体外培养的川崎病小鼠模型骨髓EPCs的粘附能力明显低于对照组。4.体外培养的川崎病小鼠模型骨髓EPCs的迁移能力明显低于对照组。5.体外培养的川崎病小鼠模型骨髓EPCs的体外血管形成能力能力明显低于对照组。6.免疫荧光(1)免疫双荧光鉴定：各LCWE处理组双阳性率明显低于对照组。(2) RBP-J κ阳性表达率：LCWE处理组在3d组、7d组、14d组明显低于对照组。(3) VEGFR-2阳性表达率：LCWE处理组在3d组、7d组、14d组明显低于对照组。第二部分：小鼠骨髓EPCs的含量和Notch4的表达1.取骨髓单个核细胞直接流式检测结果：各LCWE处理组的EPCs含量明显低于对照组。而LCWE处理组在3d组、7d组、14组Notch4(+) EPCs含量却明显高于对照组,28d组Notch4(+) EPCs含量虽然也高于对照组,但差异无显著统计学意义。2.体外培养的川崎病小鼠模型骨髓EPCs含量明显低于对照组。而Notch4(+) EPCs含量却明显高于对照组。第三部分：体外培养的小鼠骨髓EPCs的NOTCH4、RBP-Jκ、P-Selectin、 VCAM-1的mRNA水平1. NOTCH4mRNA:3d组LCWE处理组的mRNA表达水平明显低于对照组。2. RBP-Jκ mRNA:3d、7d组LCWE处理组的mRNA表达水平明显低于对照组。3. P-Selectin mRNA:3d组LCWE处理组的mRNA表达水平明显低于对照组。4. VCAM-1mRNA:各LCWE处理组与对照组差异均无显著统计学意义。第四部分：体外培养的小鼠骨髓EPCs的RBP-Jκ和VRGFR-2蛋白的表达1. RBP-Jκ蛋白：3d组LCWE处理组RBP-Jκ蛋白表达明显低于对照组。2. VRGFR-2蛋白：各LCWE处理组与对照组差异均无显著统计学意义。结论：1.川崎病小鼠模型的骨髓EPCs数量明显减少。2.川崎病小鼠模型的骨髓EPCs的各项功能和生物活性严重受损。3. Notch4-RBP-Jκ信号通路参与了川崎病冠脉损伤及修复,其具体机制需要进一步研究。