替达霉素(tirandamycins)分离自一系列链霉菌的发酵产物，含有两个特征结构单元:tetramicacid结构和双环缩酮结构。替达霉素具有广泛的生物学活性，是细菌RNA聚合酶的抑制剂，能有效的抑制转录的起始和延伸。该类化合物独特的化学结构和作用机制已经引起药物合成和生物合成化学家的广泛兴趣，然而tirandamycin生物合成机制尚不清楚。本研究通过克隆tirandamycin生物合成基因簇并对其功能进行研究，旨在阐明tirandamycin的生物合成机制，为利用组合生物合成的方法对tirandamycin进行结构改造提供依据。　　 本研究从Streptomycessp.SCSIO1666中克隆得到了tirandamycinB的生物合成基因簇，整个基因簇全长约56kb，包含15个开放阅读框，分别编码3个I型聚酮合成酶(TrdAⅠ，AⅡ，AⅢ)、1个非核糖体肽合成酶(TrdD)、1个FAD依赖的脱氢酶(TrdL)、1个细胞色素P450氧化酶(TrdI)、1个糖基水解酶(TrdE)、3个与调节和抗性相关蛋白(TrdK，TrdH，TrdJ)、两个辅助功能蛋白(TrdM，TrdB)、以及3个功能未知蛋白(TrdC，TrdF，TrdG)。　　 通过基因敲除和点突变的方法，研究了结构基因trdA1和trdD在tirandamycin生物合成中的功能。TrdA1中KS结构域和trdD中的腺苷化结构域(adenylation，A)缺失的突变株不生产tirandamycins，表明TrdAⅠ和trdD参与了tirandamycin的生物合成。TrdAⅠ中模块3的DH结构域是一个特殊结构域，对该结构域的保守催化位点的组氨酸进行了点突变，点突变菌株不能生产tirandamycins，表明此DH模块参与了tirandamycin的生物合成，但是具体的功能还不清楚。　　 通过基因敲除的方法，研究了两个调控蛋白在tirandamycin生物合成中的功能。TrdH编码一个LuxR家族的转录调节蛋白，trdH缺失突变株不能生产tirandamycins，表明TrdH在tirandamycin生物合成过程中起着正调控子的作用。TrdK编码一个TetR家族的转录调节蛋白，trdK缺失导致突变株中tirandamycinB的产量提高了一倍，这表明TrdK起着负调控的作用。　　 通过体内基因敲除、体外酶学实验以及生物转化方法研究了后修饰酶TrdE、TrdL和TrdI在tirandamycin生物合成中的功能。从trdE突变株中分离得到了tirandamycin生物合成过程中最早的中间体pre-tirandamycin。体外酶活测试表明TrdE不具有糖基水解酶作用，而是起着脱水酶的作用，负责tirandamycin中C11/C12位双键的形成。TrdE蛋白的点突变实验表明糖基水解酶的保守催化位点及C-端组氨酸对TrdE功能的维持有重要的作用。点突变蛋白E145L，H164F，H169F和H193F的构象发生了改变，丧失了催化活性。点突变蛋白E150L，D147A与野生型具有相似的构象，但催化活性分别发生了显著和中等程度的降低，E150L的Km和Kcat与野生型相比有明显的区别，表明E150是TrdE的活性催化位点。从trdL突变株中分离到两个新的中间体tirandamycinE和tirandamycinF。通过体外酶活力测试证明了TrdL在tirandamycin生物合成中起着脱氢酶的作用，负责C-10位酮基的形成。生物信息学分析结合紫外-可见光谱学分析表明TrdL属于近年来新发现的一类与辅因子FAD双共价结合的黄素蛋白。TrdI缺失的突变株主要积累tirandamycinC和一个痕量的tirandamycinC2。TrdI是一种多功能的细胞色素P450氧化酶，在tirandamycin的生物合成过程中起着多步催化作用，通过E.coliBL21(DE3)的生物转化实验证明了TrdI参与了10位羟基及C-11/C-12位环氧环的形成。　　 通过基因敲除和回补研究了保守推测蛋白TrdC及其同源蛋白SlgL在tirandamycin和streptolidigin生物合成中的功能。TrdC缺失的突变株不能生产tirandamycins，用trdC回补ΔtrdC突变株又能恢复tirandamycinB的生产，但是产量约为野生型的10％。SlgL缺失的突变株不能生产streptolidigin，用SlgL回补ΔslgL突变株又能恢复streptolidigin的生产。这些结果表明trdC和slgL分别参与了tirandamycin和streptolidigin的生物合成，但是具体功能还不清楚。　　 通过基因敲除研究了Ⅱ型硫酯酶TrdB和萜合成酶TrdF在tirandamycin生物合成中的功能。TrdB缺失突变株中tirandamycinB的产量显著下降，约为野生型的10％，推测TrdB在tirandamycin生物合成过程中起着“编辑”的功能。TrdF缺失对于tirandamycinB的合成及产量都没有影响，表明TrdF可能不参与tirandamycin的生物合成。　　 综上所述，本研究克隆得到了tirandamycin生物合成基因簇，并阐明了部分基因在tirandamycin生物合成过程中的功能，研究结果为揭示tirandamycin完整的生物合成机制奠定了坚实的基础，为利用组合生物合成的方法对tirandamycin的化学结构进行修饰和改造提供了依据。