论文部分内容阅读
激发子PB90是疫霉菌（Phytophthora boehmeriae）分泌的一种分子量为90kD的胞外蛋白激发子,该激发子可以诱发非寄主植物烟草的过敏反应和系统获得抗性。本文在阐明该激发子诱发的烟草细胞过敏性死亡是一种细胞凋亡的基础上进一步就其分子机制进行了研究。 BY-2烟草悬浮细胞经激发子PB90处理后,Trypan blue染色观察到细胞死亡,这种死亡可被蛋白质合成抑制剂Cycloheximide抑制,表明这种细胞死亡是主动死亡过程。提取PB90处理的悬浮细胞的DNA进行琼脂糖凝胶电泳观察到DNAladder现象,表明核小体间的DNA发生了断裂;对经PB90分别处理4、12h的烟草悬浮细胞进行TUNEL染色,观察到较强的阳性信号,进一步表明其细胞核内发生了DNA末端断裂;同时结合DAPI染色观察到经PB90处理后的细胞染色质凝集、细胞核解体形成凋亡小体等细胞凋亡的形态学特征。上述结果表明激发子PB90可以诱导BY-2烟草悬浮细胞发生细胞凋亡,提示该激发子诱导的过敏反应是一个细胞凋亡过程。 烟草悬浮细胞经1nmol/L PB90处理后,烟草胞内发生了NO的进发,激发子PB90处理8h内,出现两个峰值,第一个峰出现在处理后0.5h,第二个峰出现在处理后6h,且第二个峰值大于第一个峰值;PB90处理后,烟草悬浮细胞胞外培养液pH值明显升高;胞内Redox平衡状态（ASC/DHA,GSH/GSSG）发生改变。烟草细胞经PB90处理12h后,检测到细胞色素c（Cytc）从线粒体中释放到胞质,表明激发子诱导的烟草细胞凋亡可能与动物细胞凋亡具有相类似的机制。此外,PB90还诱导了烟草Bax inhibitor（TBI）基因及防卫基因PRla、PRlb、PRlC基因的表达,表明PB90诱导烟草细胞凋亡的过程中伴随着防卫反应的激活。进一步利用抑制剂法进行研究,结果显示Ca2+整合剂EGIA（5mmol/L）、Ca2+通道抑制剂LaCl3（0.1mmol/L）、NO合酶（NOS）抑制剂L-NAME（0.2mmol/L）、NADPH氧化酶抑制剂DPI（10μmol/L）和蛋白质合成抑制剂Cycloheximide（CHX,0.4mmol/L）可不同程度地抑制PB90诱导的烟草胞内RedoX平衡状态的改变,TBI基因及PR1a、PR1b、PR1C基因的表达,也可不同程度地抑制PB90诱导的烟草细胞凋亡,且随着处理时间的延长,抑制剂对PB90诱导烟草细胞凋亡的抑制率呈增加的趋势（DPI除外）,表明信号分子Ca2+、NO、H2O2参与了激发子PB90诱导的烟草细胞凋亡,也参与了PB90诱导的烟草防卫反应,提示激发子PB90诱导烟草细胞凋亡的信号通路与防卫反应的信号通路有部分重叠。