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大型真菌是一类重要资源,含多种生理活性物质。α-半乳糖苷酶能够催化水解α-半乳糖苷键,在食品及饲料等工业领域用来降解抗营养因子大豆低聚糖。本论文对多种大型真菌进行菌种分离和酶活性筛选,选择α-半乳糖苷酶活性较高的大型真菌进行发酵研究,并从发酵液中分离纯化α-半乳糖苷酶,研究酶的生理生化性质以及对底物的降解效果。主要研究结果如下:采集野生大型真菌子实体,通过组织分离法纯化得到23株大型真菌菌种。用ITS序列分析法进行种属鉴定,其中16株可以鉴定到种,7株鉴定到属。通过活性筛选选择粪生花褶伞和白囊耙齿菌作为分离纯化α-半乳糖苷酶的实验材料。对粪生花褶伞进行发酵研究,确定最优种子培养基为:玉米淀粉20 g/L、酵母粉7 g/L、K2HPO4·3H2O1g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L,种子培养时间为5天;确定适宜的发酵培养基为:可溶性淀粉 90g/L、酵母粉 40g/L、K2HPO4·3H2O 1g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L,发酵培养时间为9天。优化后发酵液中α-半乳糖苷酶活性为0.93 U/mL,与初始发酵培养基中的酶活0.03 U/mL相比,提高了 31倍。从粪生花褶伞发酵液中分离纯化得到的α-半乳糖苷酶分子量为66 kDa,单亚基蛋白。酶作用于底物pNPG的最适pH为4.0,在pH 2.0～10.0之间保持稳定;最适温度为60℃,温度低于50℃时保持稳定。Ag+和Fe3+彻底抑制酶活,Fe2+在高浓度(10 mM)下提高酶活,化学修饰剂NBS强烈抑制酶活。该酶可以水解棉子糖等低聚糖,在饲料等工业中有潜在的应用价值。对白囊耙齿菌进行发酵研究,确定最优培养基为:可溶性淀粉20 g/L、蔗糖30 g/L、豆粕80g/L、CaCl23 g/L、K2HPO4·3H2O1g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L、(NH4)2SO40.5g/L;通过测定发酵曲线,选择11天为发酵时间。优化后发酵液酶活为5.75 U/mL,与初始发酵培养基的酶活0.028 U/mL相比,提高了 205倍。从白囊耙齿菌发酵液中分离纯化得到一种α-半乳糖苷酶,分子量为60 kDa,单亚基蛋白。酶作用于底物pNPG的最适pH为5.0,酸碱稳定性好,在pH 2.0～12.0之间保持稳定:最适温度为80℃,温度稳定性好,在4～70℃的温度范围内保持稳定,60℃处理12 h酶活性无明显下降,70℃处理5h保持大于70%的活性,80℃处理2 h仍保持部分活性。Hg2、Ag2+、Fe3+ 抑制酶活,化学修饰剂NBS彻底抑制酶活。该酶抗蛋白酶能力较强;能耐受高浓度蔗糖和葡萄糖,但被半乳糖抑制,抑制常数Ki和Kis分别为3.34和0.29 mM。该酶能高效降解pNPG、蜜二糖、棉子糖和水苏糖,对刺槐豆胶、瓜尔豆胶的降解性较差。该酶对不同底物的米氏常数(Km)为:pNPG<蜜二糖<水苏糖<棉子糖;最大反应速率(Vmax)为:蜜二糖<pNPG<水苏糖<棉子糖。该酶在1.5 h内彻底降解10mM水苏糖,能有效降解豆饼粉和大豆中的高浓度低聚糖,在饲料食品等工业领域中有一定的应用价值。以上实验结果表明,两株大型真菌,尤其白囊耙齿菌,易于通过液体深层发酵扩大培养规模并通过条件控制提高酶产量。来源于白囊耙齿菌的α-半乳糖苷酶性质稳定,底物降解能力强,来源安全容易培养,有一定的工业应用价值。本研究为两株大型真菌的大规模发酵生产α-半乳糖苷酶提供了前期实验基础,并为α-半乳糖苷酶的进一步应用提供了理论基础和科学依据。