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背景与目的:人脑多形性胶质母细胞瘤(Glioblastomamultiforme,GBM)是成人颅内恶性程度最高的肿瘤,其亚型中间叶型(Mesenchymal)最具恶性并且肿瘤生长环境缺氧严重,坏死组织多。缺氧是造成上皮间叶转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)及肿瘤侵袭性增加的重要因素,但对于缺氧环境如何促进胶质瘤EMT及肿瘤侵袭性的相关机制尚不完全清楚。缺氧诱导因子α(HIFα)是缺氧环境下至关重要的转录调节因子,能够调控一系列靶基因的表达过程,影响胶质瘤EMT。缺氧下细胞反应主要受缺氧诱导因子(HIF)家族调节。HIFs家族是由氧气敏感型HIFα亚单元和组成型表达的HIFβ亚单元构成的异二聚体。常氧下,vHL会促进HIFα发生泛素化而使HIFα被蛋白酶体降解,所以常氧下HIFα几乎不表达。缺氧下,HIFα因与vHL的交互作用被阻断而表达稳定,并与HIFβ形成二聚体,以及HIFα结合下游靶基因的启动子序列,激活转录。众多缺氧调节基因的转录激活能够调控细胞各种生理状态,包括生存、运动、转移及新生血管形成等,以维持缺氧下氧气动态平衡。HIFα又主要分为HIF-1α和HIF-2α,两种DNA结构域相似的HIFα亚单元HIF-lα和HIF-2α,靶向调控下游不同靶基因而发挥不同功能。因此,寻找HIFα下游靶基因对阐明GBM的强侵袭性及EMT过程意义重大。G蛋白偶联受体激酶相互作用蛋白2[G-protein-coupled receptor(GPCR)kinase interacting protein 2 GIT2]是GIT蛋白家族的重要成员之一,N端带有GTP酶-激活蛋白结构域。GIT2具有GTP酶活性,能够靶向调节Arf1和Arf6,影响细胞膜交联与肌动蛋白重塑。研究发现GIT2能与多种分子相互作用,例如G蛋白偶联受体激酶相互交换作用因子PIX和桩蛋白paxillin,并且在细胞间粘附聚集与分散、细胞极性及粘附细胞定向迁移运动中意义深远。近期研究报道GIT2参与了多种肿瘤的转移,并发挥一定作用。例如,GIT2抑制Rac-依赖性片状伪足延伸,抑制人宫颈癌HeLa细胞的传播转移;膀胱癌细胞中GIT2缺失能通过调控miR146a-ZEBl表达诱导EMT;稳定表达的GIT2还能参与肺癌细胞迁徙运动。然而GIT2在胶质瘤中尚无研究进展,本文主要针对GIT2在胶质瘤中表达水平和功能及其与缺氧EMT促进胶质瘤侵袭性之间的关系进行研究。在本研究中,我们发现GIT家族分子GIT2蛋白质在胶质母细胞瘤细胞系及胶质瘤患者样本组织样本中高表达,数据分析显示间叶型胶质瘤中GIT2表达明显高于其它亚型,敲低GIT2后胶质瘤细胞侵袭性与细胞增值能力明显降低。更为重要的是,缺氧诱导下升高的HIF-1α能够结合GIT2启动子上的缺氧反应元件(hypoxia-responsive elements,HREs),激活 GIT2 启动子区域,促进缺氧下GIT2表达上调及侵袭能力增强。为进一步阐明缺氧下GIT2影响胶质瘤侵袭能力的作用机制,我们发现GIT2能够抑制重要EMT转录因子TWIST1,SNAIL1和ZEB1的泛素化水平,减少其降解,稳定其蛋白表达水平。GIT2还能在转录水平直接调节许多EMT标记物。我们的研究结果揭示了 GIT2是介导HIF-lα与EMT的中间桥梁,对胶质瘤的发生发展起到至关重要的作用,是分子靶向治疗胶质瘤的一个重要的新方向。研究方法:1.qRT-PCR、Western blot 检测 5 种 GBM 细胞系 GIT2 的 mRNA、蛋白表达;并在胶质瘤样本组织及肿瘤周边组织中检测GIT2的表达。2.在U87和A172细胞系中敲低GIT2;体外实验通过克隆形成实验,Transwell小室侵袭实验和划痕实验检测GIT2对胶质瘤侵袭和增殖能力的影响。3.qRT-PCR检测U87细胞系缺氧时间梯度和CoC12浓度梯度下的GIT2表达;Western blot检测4种GBM细胞系和原代细胞HIF-1α和GIT2的蛋白表达,缺氧时间梯度HIF-I α、GIT2、EMT转录因子的蛋白表达,缺氧下敲低HIF-1α或HIF-2 α后GIT2蛋白表达,缺氧或CoC12处理后过表达显性负突变体HIF-1 α及缺氧下使用HIF-1 α抑制剂KC7F2下GIT2蛋白表达;免疫荧光检测缺氧下GIT2表达情况。4.qRT-PCR,Westem blot验证HIF-lα与GIT2靶向关系,划痕实验、Transwell小室侵袭实验、克隆形成实验验证缺氧下GIT2对胶质瘤细胞侵袭、增殖的调控作用。5.通过荧光素酶基因报告实验研究HIF-lα调控GIT2机制,染色质免疫共沉淀技术寻找HIF-1 α与GIT2启动子区域结合靶点6.qRT-PCR、Westemblot、免疫荧光、免疫组化检测GIT2与EMT基因调控关系;7.Western blot检测胶质瘤细胞与293T细胞GIT2稳定EMT转录因子情况,免疫共沉淀实验检测TWIST1、ZEB1、SNAILI泛素化水平。8.数据库中验证GIT2与HIF-lα、SNAIL1、TWIST1、ZEB1蛋白表达相关,并检验GIT2高表达或低表达与胶质瘤患者整体生存率的相关性。研究结果:1.GIT2在胶质瘤细胞系中表达上调。2.下调GIT2能够降低胶质瘤细胞U87和A172的侵袭、迁移和增殖能力。3.缺氧下GIT2表达上调,并受到HIF-I α调控,缺氧下敲低GIT2表达水平明显降低了 U87和A172细胞的侵袭、迁移和增殖能力。4.缺氧下HIF-lα结合GIT2启动子,转录水平调控GIT2。5.下调GIT2,SNAILI、TWISTI和ZEB1转录水平表达不变,蛋白表达水平降低,其他EMT标记物的RNA和蛋白水平均降低。6.在GBM细胞中下调GIT2后,SNAILI,TWISTI和ZEB1发生泛素化,在293T细胞中导入外源性GIT2后,SNAIL1,TWIST1和ZEB1表达稳定,泛素化减少。7.数据库分析GIT2表达与HIF-1 α、SNAILI、TWISTI、ZEB1蛋白表达正相关,高表达GIT2的GBM患者生存率明显低于低表达GIT2的GBM患者。研究结论:1.缺氧下HIF-1 α结合GIT2启动子,转录激活GIT2胶质瘤中高表达2.GIT2通过抑制SNAILI,ZEB1,TWISTI泛素化,稳定EMT转录因子蛋白表达,并且直接调控相关EMT标记物,促进缺氧下胶质瘤细胞侵袭性增强,GIT2作为介导缺氧与EMT的中间桥梁在胶质瘤发展中起到重要作用。