S基因型H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)是当前的主流基因型,并以完整内部基因盒的方式频繁地为H7N9、H10N8和H5N6等致人感染的新型重配流感病毒提供全套内部基因。当前H5和H9亚型AIV在国内共同流行,使得两者极易发生自然重配,并且禽及人感染病例中均已出现了内部基因完全来源于H9N2的新型重配H5病毒。因此,为了评估此类重配病毒的生物危害,迫切需要探讨当前优势S基因型H9N2病毒的内部基因盒对不同进化分支H5病毒致病力的影响。S基因型H9N2病毒是在国内前期流行的H基因型骨架上先后引入了 G1-like进化谱系的M和PB2基因,即分别替换掉F/98-like进化谱系的M和PB2基因而形成的。然而,不同H9N2进化谱系的PB2和M基因对于重配H5病毒会产生什么样的生物学效应?其相关的分子机制又如何?本文研究了不同基因型H9N2内部基因盒对当前优势流行H5亚型AIV致病力的影响,并进一步探究了其致病力差异的分子机制和宿主因素。我们发现S基因型H9N2的全套内部基因能明显降低重配H5病毒对鸡和小鼠的致病力。但是,与S基因型相比,含H基因型内部基因盒的H5亚型重配病毒在鸡和小鼠中的毒力更弱。进一步地,我们发现含有G1-like M或G1-like PB2基因的重配H5病毒比含有F/98-like M或F/98-like PB2基因的重配H5病毒在SPF鸡和BABL/c小鼠上具有更强的适应性。此外,进一步通过研究PB2和M基因的分子功能发现,G1-like PB2可通过增强RNP聚合酶活性和PB2蛋白的核输入效率,而G1-like M则通过增加球形病毒粒子比例和协助RNP核输出效率来增强重配H5病毒在动物模型中的生存力。最后,从宿主因素的角度,我们应用差异蛋白组探索了重配H5病毒致病性差异的分子机制,发现相比内部基因盒为H基因型的重配H5病毒(H5/H),内部基因盒为S基因型的重配H5病毒(H5/S)介导的更强烈的先天性免疫应答可能与其在鸡模型上的高毒力相关。1.S基因型H9N2内部基因盒对H5亚型重配病毒致病力的影响S基因型H9N2流感病毒频繁提供全套内部基因给其它新型重配病毒,如H7N9、H10N8、H5N2及H5N6,对人类的健康和养禽业的发展构成巨大的威胁。但是,含S基因型H9N2病毒内部基因盒的重配H5病毒(H5/S)对鸡和小鼠的致病性和传播性的影响知之甚少。在本研究中,利用反向遗传技术获得4株H5亚型重配病毒,其外部基因来自不同流行分支的H5 HPAIV,而内部基因盒来自当前优势流行的S基因型H9N2病毒。我们发现重配病毒H5/S对SPF鸡和BABL/c小鼠的毒力相比各自的母本H5病毒均降低,且H5/S引起的平均死亡时间比各自母本H5病毒更长。与此相一致,H5/S的聚合酶活性、病毒在哺乳动物细胞和禽类细胞上的复制能力以及在鸡和小鼠肺脏的细胞因子应答能力均比各自母本H5病毒更低。此外,SPF鸡的传播效率试验结果显示所有H5/S病毒均具有直接接触传播能力但无气溶胶传播能力,并且H5/S病毒喉头排毒时间能持续到至少第7天。因此,以上结果表明S基因型H9N2病毒内部基因盒在致弱重配H5病毒对鸡和小鼠的致病性和延长排毒时间中扮演着重要作用,并且我们推测致弱的此类重配H5病毒在哺乳动物和禽类动物中可能更易流行。2.H9N2不同进化谱系PB2和M基因对重配H5病毒在禽类动物模型上致病性的影响及机制探索S基因型H9N2亚型AIV,自2010年以来,在我国已经发展成优势流行基因型,且频繁提供内部基因给新型重配病毒如H5N6、H10N8和H7N9等。S基因型病毒是在早期的H基因型病毒内部基因骨架上将F/98-like的M和PB2基因替换为G1-like的M和PB2基因而形成的。但是,这种不同进化谱系基因片段的替换是如何影响新型重配流感病毒的适应性目前还不清楚。在本研究中,我们发现相比较于H5/H,重配H5/S病毒在CEF细胞上和SPF鸡模型上显示出更强的毒力和复制能力。并且,G1-like PB2基因比F/98-like PB2基因赋予重配H5病毒更高的聚合酶活性和更强的核输入效率,而G1-like M基因比F/98-like M基因赋予重配H5病毒更多的球形病毒粒子和更有效的RNP核输出。因此,我们的结果表明含有G1-likeM和PB2基因的S基因型H9N2内部基因盒,优于含有F/98-like M和PB2基因的H基因型H9N2内部基因盒,更有助于重配H5病毒的适应,从而可以部分解释为什么S基因型频繁参与致人感染的新型重配病毒的出现。3.H9N2不同进化谱系PB2和M基因对重配H5病毒在哺乳类动物模型上致病性的影响及机制探索S基因型H9N2 AIV频繁为H5N6、H10N8和H7N9等感染人的重配流感病毒提供内部基因。S基因型的一个关键特征表现在早期的F/98-like M和PB2基因被G1-like M和PB2基因替代。但是,究竟何种H9N2内部基因组合对病毒在哺乳动物上的适应性提高有贡献目前还不甚清楚。在本研究中,我们发现含G1-likeM或G1-like PB2基因的重配H5病毒相比含有F/98-like M或F/98-like PB2基因的重配H5病毒在小鼠中具有更强的毒力和复制能力。与此相一致,重配H5病毒携带G1-llike M或G1-like PB2基因相比携带F/98-like M或F/98-like PB2基因在哺乳动物细胞上显示出更高效的复制能力和更高的病毒蛋白表达水平。并且,相比较于M基因,PB2基因的作用更关键。进一步的研究发现,相比F/98-like PB2和M,G1-like PB2基因赋予重配H5病毒更强的聚合酶活性和更高的PB2蛋白核输入效率,而G1-like M基因赋予重配H5病毒更多的球形病毒粒子和更高效的RNP核输出效率。因此,我们的结果表明H9N2病毒的G1-like M或G1-like PB2基因能赋予H5亚型重配病毒更强的适应性,从而可能增强新型重配病毒感染哺乳动物的能力。4.基于TMT技术研究含S和H基因型H9N2内部基因盒的重配H5病毒感染鸡肺脏的差异表达蛋白前期研究表明,含有S基因型或H基因型H9N2内部基因盒的重配H5病毒在SPF鸡中的致病性存在显著差异。含有S基因型的H5/S重配病毒对鸡表现为高致病性,而含有H基因型的H5/H重配病毒为低致病性。在本研究中,为了探究造成这种致病性差异的宿主因素,我们系统比较了 H5/S和H5/H重配病毒对鸡的毒力和感染鸡后的肺脏差异蛋白质组学。我们发现H5/S诱发鸡严重的肺损伤,而H5/H仅仅引起鸡肺脏轻微的损伤。通过TMT联合LC-MS/MS蛋白定量技术,首先,我们发现H5/S刺激宿主的差异蛋白数目明显多于H5/H。进一步差异蛋白生物功能分析结果表明,H5/S诱导宿主的先天性免疫应答相关生物学功能明显强于H5/H,其中包括炎症反应、杀死细胞和细胞因子反应等。与此相一致,KEGG通路分析进一步证实了 H5/S刺激宿主先天性免疫反应相关的通路多于H5/H,并对病毒的感染产生了广泛的生物学效应,其中包括NOD-like受体信号通路、MAPK信号通路、RIG-Ⅰ-like受体信号通路、Toll-like受体信号通路和A型流感感染等。此外,我们还发现H5/S所诱导的差异蛋白,RELA,参与了病毒感染反应中的许多重要通路。因此,我们的结果表明H5/S诱导的肺损伤相关的宿主先天性免疫应答反应可能有助于增加肺病变程度,从而增强重配病毒对鸡的毒力。