论文部分内容阅读
目的:筛选乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）疫苗接种后超高和极低乙肝表面抗体（Hepatitis B virus surface antibody,HBsAb）水平的健康志愿者,监测其接种前、第二次接种后、第三次接种后和接种四年后的HBsAb水平和变化情况,解析相应时间点Ig G-H CDR3受体库的组成和动态变化特征。详细对比分析每个超高和极低HBsAb水平个体HBV疫苗接种前后HBsAb水平变化差异及对应的Ig G-H CDR3受体库组成特征差异,探讨HBV疫苗接种后B细胞超高和极低HBsAb水平的产生机制,此外本课题为通过疫苗寻找高HBsAb水平技术、HBV感染防治等提供基础数据和新的研究思路。方法:1.样本采集:从遵义医科大学珠海校区在校的721名学生志愿者中,筛选到符合本实验HBV疫苗接种条件的志愿者48名,并按标准HBV疫苗接种程序接种。在第二次接种后,根据HBsAb水平选取超高HBsAb水平志愿者（H组）5名（HBsAb＞10000m IU/m L）,极低HBsAb水平志愿者（L组）5名（HBsAb＜10 m IU/m L）。以接种前（T1）、第二次接种后（T2）、第三次接种后（T3）和HBV疫苗全程接种四年后（T4）采集志愿者外周血作为研究样本。2.HBsAb水平的检测:在接种前用ELISA法检测乙肝五项标志物水平,在第二次接种后和第三次接种后分别获得10名志愿者血清3m L,接种四年后获得9名志愿者血浆2m L,分别用化学发光法检测HBsAb水平。B细胞、记忆B细胞和浆细胞比例检测:在第二次接种后采集10名志愿者10m L外周血,用流式细胞术检测。3.BCR-H CDR3受体库建库原理和流程:提取每个样本外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMCs）的总RNA,逆转录为c DNA,按人BCR-H CDR3受体库制备技术,多重PCR扩增各样本中BCR-H CDR3受体库,采用Illumina Hi SeqⅩTen测序平台高通量测序（High-Throughput Sequencing,HTS）技术测序BCR-H CDR3受体库（测序由华大基因公司完成）。4.测序数据处理和分析:将测序得到的各样本BCR-H CDR3受体库数据提供至NCBI数据库进行比对,并将比对后的序列进一步使用R自定义脚本对序列进行聚类,聚类规则:使用相同的IGHV和IGHJ基因片段、具有相同长度的CDR3氨基酸序列,并且每12个氨基酸不超过1个错配（数据比对及聚类由杭州艾沐蒽生物科技有限公司完成）。将聚类后数据进行特征分析:CDR3受体库多样性、IGHV-IGHJ基因家族取用和配对特征、CDR3长度、氨基酸取用、重叠特征和抗HBV抗体序列的对比分析、BCR受体库的体细胞高频突变和插入与剪切特征等。使用IBM SPSS Statistics 22软件分析个体HBV疫苗接种前后和两组间数据统计结果,采用Mann-Whitney U检验和Kruskal-Wallis检验进行统计分析,采用Spearman相关系数进行相关性分析。所有数据用双尾检验进行分析,检验水准均为α=0.05。“*”代表P＜0.05,“**”代表P＜0.01,“***”代表P＜0.001。结果:1.HBsAb水平:接种前所有志愿者乙肝五项标志物均为阴性;HBV疫苗接种第二针后,5名志愿者表现为超高HBsAb水平,5名志愿者为极低HBsAb水平;HBV疫苗接种第三针后,L组中有3名HBsAb水平升高至保护水平以上;全程接种HBV疫苗四年后,10名志愿者HBsAb水平均下降,但H组仍维持在较高水平。B细胞、记忆B细胞和浆细胞比例:第二次接种后H组记忆B细胞的比例略高于L组。2.CDR3受体库的多样性:H组第二次接种后多样性降低,第三次接种后多样性升高,并且与接种前存在统计学差异;L组多样性变化趋势与H组相似,但无统计学差异。3.IGHV和IGHJ基因家族的取用和配对:与L组相比,H组中IGHV1-18,IGHV2-26,IGHV2-5,IGHV3-21,IGHV3-23,IGHV3-33,IGHV3-7,IGHV3-74,IGHV3-9和IGHV7-27的取用频率在两次接种后均高于接种前;IGHJ基因取用差异不显著,H组和L组均高频取用IGHJ4;IGHV1-18-IGHJ4,IGHV4-4-IGHJ4和IGHV6-1-IGHJ4配对在H组的频率明显高于L组。4.CDR3长度分布和氨基酸取用:接种前、第二次接种后和第三次接种后CDR3长度相似,主要以12-15个长度的氨基酸为主;而接种四年后H组和L组都出现较长序列的显著克隆扩增,主要以14-16个长度的氨基酸为主。在氨基酸取用中,H组和L组每个样本均高频取用精氨酸（R）、天冬氨酸（D）、酪氨酸（Y）、丝氨酸（S）、甘氨酸（G）和丙氨酸（A）。5.CDR3重叠:H组每个样本HBV疫苗相关性簇主要表现为接种前低频或不存在,而接种后克隆扩增明显,而L组主要表现为接种前和第三次接种后克隆扩增较一致。将H组筛选出的HBV疫苗相关性簇中包含的序列与已报道文献中HBV相关序列进行比对,在多个样本中均发现与HBV相关序列存在共同保守基序（motif）:“YGLDV”、“DAFD”、“YGSGS”、“GAFDI”和“NWFDP”。6.体细胞高频突变:第三次接种后H组平均突变率略高于L组;第三次接种后,H组突变核苷酸个数“151-200”和“＞200”显著增加,而L组仅在突变核苷酸个数“151-200”出显著增加。插入与剪切:核苷酸的插入与剪切的平均数目在H组和L组中无明显差异。结论:1.HBV疫苗接种四年后超高HBsAb水平志愿者HBsAb仍然维持在较高水平,极低HBsAb水平志愿者不能产生持续性保护抗体,并且研究结果显示超高HBsAb水平志愿者疫苗接种后激发了相应B细胞的显著克隆增殖。2.超高HBsAb水平志愿者对IGHV基因家族取用及IGHV-IGHJ配对具有一定偏向性;重叠簇大多是在HBV疫苗接种后出现高克隆扩增,接种前低频存在或不存在;并且经历了更多体细胞高频突变,都提示与疫苗应答后不同HBsAb水平机制相关,并且超高HBsAb水平志愿者的这些重叠簇可能与高HBsAb水平相关。