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丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)感染是慢性肝病的重要病因之一,全球约有2.5%的人口感染丙型肝炎病毒。慢性HCV感染可引起脂肪肝(Liver steatosis)、病毒相关脂肪性肝炎(Virus-associated steatohepatitis,VASH)、肝纤维化(Fibrosis)、肝硬化(Cirrhosis),甚至肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)。其中肝细胞脂肪变性(Hepatic steatosis)是慢性HCV感染的重要临床病理表现。目前研究表明,HCV的生存周期及其感染性与肝脏脂质代谢状态关系密切,而一些病毒蛋白也直接参与宿主细胞的脂代谢调控,但具体调控机制仍有待深入研究。HCV在宿主体内可合成多种结构蛋白(Core、E1和E2)和非结构蛋白(p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B),这些蛋白与其在宿主细胞中的生命周期密切相关。在HCV感染肝细胞中,病毒蛋白与宿主蛋白相互作用,并在脂滴表面形成由内质网衍生而来的“膜网”(Membranous web),从而进行病毒的复制和包装。脂滴(Lipid droplet,LDs)不仅作为一个贮存中性脂质的细胞器,也是HCV病毒复制和组装发生的重要结构。在脂滴相关的病毒复制复合体(Replication complex)中,NS5A的作用最为重要,其能够与多种脂肪酸合成酶、脂滴转运蛋白等相结合,同时影响细胞内脂滴的代谢。Perilipin家族是最为重要的一类脂滴表面蛋白(LD-associated protein,LDP),Perilipin 5(Plin5)表达于利用线粒体β-氧化(β-oxidation)活跃的组织及器官中,包括肝脏、骨骼肌、心肌和棕色脂肪组织(Brown adipose tissue,BAT)等。研究认为,Plin5能够作为能量感受器,感知非酯化脂肪酸(Non-esterified fatty acid,NEFA)水平,并通过调控脂滴水解和线粒体脂肪酸β-氧化,调控细胞脂质代谢过程。Plin5缺失可使肝脏甘油三酯(Triglyceride,TG)含量显著减少,并促进细胞内脂肪酸氧化分解,增加脂质过氧化(Lipid peroxidation),从而引起肝脏损伤。然而,Plin5在HCV感染所诱导的脂质代谢紊乱中的具体作用和机制仍须深入研究。目的:(1)利用Plin5敲除小鼠和原代肝细胞,探讨Plin5缺失在HCV NS5A诱导的肝脏炎症损伤、氧化应激、脂质过氧化中的具体作用。(2)通过体内外实验,观察Plin5缺失时NS5A诱导的肝脏脂质及其主要代谢产物的变化,以及甘油三酯(TG)水解速度的变化,进一步探究Plin5在NS5A介导的肝脏脂质代谢紊乱中的具体作用。(3)确定Plin5与NS5A的相互作用及其相互作用结构域,以阐明Plin5在HCV NS5A调控肝细胞脂质代谢紊乱中的作用机制。方法:首先我们构建过表达NS5A的腺病毒,通过尾静脉注射,感染野生型和Plin5敲除小鼠,观察Plin5缺失对NS5A诱导的肝细胞损伤、炎症反应和脂代谢紊乱等的影响;在体外,利用腺病毒感染野生型和Plin5缺失原代肝细胞,以及在HepG2细胞中过表达NS5A和/或Plin5,观察肝细胞脂滴形态和数量、脂质含量、脂滴水解速度、氧化应激(Oxidative stress)等指标,并确定Plin5在表达NS5A的肝细胞中的主要作用;最后,利用免疫荧光(IF)和免疫共沉淀(Co-IP),确定NS5A与Plin5的相互作用,及其对Plin5定位的具体影响,探讨Plin5在NS5A诱发肝细胞脂代谢紊乱和损伤中的作用。结果:(1)通过尾静脉注射表达HCV NS5A腺病毒1周后,H&E染色和免疫组化染色显示,Plin5缺失能够显著加重NS5A诱发的肝脏损伤,肝脏F4/80阳性巨噬细胞的数量增多。血清分析显示,Plin5缺失小鼠血清中转氨酶与炎性因子水平在NS5A诱导下显著升高。同时,Plin5缺失显著加重NS5A诱导的ROS、MDA和4-HNE的水平升高,但在野生型小鼠肝脏和原代肝细胞中NS5A的影响均较小。此外,在HepG2细胞中,Plin5过表达能够抑制NS5A诱发的ROS、MDA和4-HNE水平增加。这些体内及体外实验结果均证实,Plin5能够抑制由HCV NS5A诱导的氧化应激及肝脏损伤。(2)通过进一步研究,我们发现NS5A能够增加野生型小鼠肝脏及原代肝细胞中的脂质含量,但Plin5缺失却显著降低NS5A的促脂质储积作用。同时,我们发现在Plin5缺失的条件下,NS5A能够显著加快肝脏组织和原代肝细胞中TG的水解速度,增加NEFA的含量,但在野生型原代肝细胞中NS5A的影响较小。在HepG2细胞中,NS5A能够增加细胞内NEFA水平,并加快TG水解速度,但同时过表达Plin5能够抑制NS5A诱导的TG水解加快,降低细胞内NEFA水平,并增加细胞内TG含量。这些实验结果表明,Plin5能够抑制表达NS5A细胞中的脂解作用,并增加细胞内脂质含量。(3)为明确分子机制,我们利用免疫荧光发现NS5A与Plin5在肝细胞中共同定位于脂滴表面;利用亚细胞器分离技术和Western blot,我们发现NS5A能够招募Plin5到脂滴表面,但对肝细胞内Plin5的表达量没有影响。最后,免疫共沉淀实验(Co-IP)显示,NS5A同Plin5能够相互作用;进一步利用Plin5截短体进行Co-IP,结果显示Plin5N端(32-128aa)是其与NS5A作用的关键结构域。结论:Plin5能够抑制HCV NS5A诱导的肝脏和肝细胞损伤。NS5A能够与Plin5相互作用,并将其招募至脂滴表面。在脂滴表面,Plin5能够抑制脂解过程,促进细胞脂质储积,并减轻NS5A诱发的肝脏损伤。本研究不仅有助于认识脂滴蛋白Plin5在脂滴代谢中的具体作用,也为认识HCV感染相关脂质代谢紊乱的发生机制提供实验基础。