【摘 要】
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背景:环状RNA(circular RNA,circRNA)是由宿主基因反向剪接产生的一类特殊的环形非编码RNA。circRNA能够对基因表达调控网络进行微调,从而参与多种生物过程和疾病发生。目前已开发多种基于circRNA表达模式和序列特征的方法,以系统鉴别具有潜在生物学功能的circRNA分子。然而,一方面由于circRNA具有表达量低、定量难度大、公开数据少等特点,限制了基于表达水平的功能性
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背景:环状RNA(circular RNA,circRNA)是由宿主基因反向剪接产生的一类特殊的环形非编码RNA。circRNA能够对基因表达调控网络进行微调,从而参与多种生物过程和疾病发生。目前已开发多种基于circRNA表达模式和序列特征的方法,以系统鉴别具有潜在生物学功能的circRNA分子。然而,一方面由于circRNA具有表达量低、定量难度大、公开数据少等特点,限制了基于表达水平的功能性circRNA筛选;另一方面,circRNA发挥功能依赖于其内部序列,但由于与同源线性和环状转录本序列重叠,在功能筛选时难以确定目标分子。这些困难限制了对circRNA功能的认识,在目前已发现的上百万的circRNA中,只有少数circRNA有功能报道。因此,开发新的测序技术和分析方法,来精准鉴别功能circRNA分子,对于理解circRNA的功能与作用机制具有重要意义。方法:利用人类脑组织RNA-seq和基因型数据分析circRNA数量性状座位点(circRNA quantitative trait loci,circQTL)。结合 circQTL 和疾病风险位点分析与疾病有关的circRNA。基于环线比开发的DEBKS用于鉴定差异表达circRNA,并用RNA-seq和RT-qPCR的方法评估DEBKS的准确性。开发全长circRNA测序方法和算法circFL-seq 用于鉴别 circRNA 内序列,并通过 RNA-seq、RT-qPCR、PCR、Sanger 测序评估circFL-seq鉴定circRNA的性能。结果:(1)本研究从589例人类脑组织中鉴别出10.559个高质量的circRNA,鉴定了表达水平与多种生物学和技术因素相关的circRNA。(2)提出circQTL概念并鉴定出196,255个circQTL,结合疾病风险位点分析鉴别出157个与精神分裂等多种复杂疾病相关的circRNA。(3)基于环线比开发了 circRNA差异表达分析软件DEBKS,真实数据和模拟数据均证实DEBKS的敏感度和精准度高于现有软件。(4)开发了全长circRNA测序方法circFL-seq,从7个人类细胞系和2个人类组织中重建了 77,606个高质量的全长circRNA。(5)利用circFL-seq在六个细胞系中检测出23,267个高质量内部可变剪接事件,包括44.3%的外显子跳跃(ES)、28.1%的可变3’剪接位点(A3SS)、24.1%的可变5’剪接位点(A5SS)和3.5%的内含子保留(IR)事件,在人类乳腺癌细胞系MCF7中鉴别出融合基因产生的6个融合circRNA。(6)基于circFL-seq鉴定了4,221个circRNA特有外显子,序列特征分析显示这些分子可能发挥着重要功能。结论:本研究针对功能circRNA鉴定中宿主基因线性转录本对circRNA表达定量和序列特征分析的干扰,开发了一系列测序技术和生物信息学算法:建立了基于大规模RNA-seq的circQTL分析方法,从遗传表达调控网络层面鉴定与疾病相关的circRNA;开发的DEBKS去除线性基因的干扰,直接鉴别反向剪接的功能作用;开发的circFL-seq有效的区分circRNA内序列差异,为基于序列特征和转录后调控分析的功能circRNA大规模筛选提供了有力工具。总之,本研究拓展了鉴定功能circRNA的方法学基础。
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